郝小康 综述，郭瑞林 审校

(陕西中医药大学医学技术学院，陕西咸阳 712000)

·综述·

乙型肝炎病毒相关性肾炎实验室检查方法研究进展

郝小康 综述，郭瑞林 审校

(陕西中医药大学医学技术学院，陕西咸阳 712000)

关键词:乙型肝炎;肾炎;临床实验室检查

乙型肝炎(下称乙肝)病毒相关性肾炎(HBV-GN)是HBV诱发的肾小球肾炎，由于我国HBV感染较高，人群中 HBV 携带率高达 10%,由此引起的肾脏损害亦非常常见。史文丽等[1]研究显示，HBV-GN约占肾活检0.25%。HBV-GN的发病机制较为复杂，涉及多种学说：包括免疫复合物介导、HBV直接感染肾脏、HBV诱发的自身免疫、免疫缺陷、遗传因素等[2]。目前国内在HBV-GN的诊断上还有待深入研究讨论，而国外由于HBV感染的低发生率，没有制定相应的标准，现在很多医院临床大夫仍在沿用1989年HBV-GN座谈会制定的初步诊断标准[3]。2001年全国肾活检病理诊断研讨会制定了HBV-GN诊断标准[4]：通过免疫组化方法在肾小球内检测出HBV抗原(HBV-Ag)阳性，方可诊断为HBV-GN。2004年黎磊石院士也提出了关于HBV-GN的诊断标准。由于一些学者在血清HBV标志物阴性儿童的肾脏中检测到HBV标志物，并且结合临床表现可以诊断HBV-GN，所以修订了HBV-GN的标准[5-6]。多数学者认为，肾组织中HBV抗原阳性的患者，结合肾脏典型病理表现，可以诊断为HBV-GN，而对于血清HBV-Ag阳性，肾组织HBV-Ag阴性的患者则不能诊断HBV-GN。所以肾组织HBV标志物的检测对于HBV-GN的诊断意义重大。HBV标志物在肾脏中的检测一直存在问题，实验室关于肾组织HBV标志物的检测，目前主要包括免疫荧光法、免疫组织化学法(下称免疫组化法)、核酸分子检查这3种方法，现将这3种实验室检查方法原理及优缺点综述如下。

1免疫荧光法

1961年Dixon开始在肾脏疾病中应用免疫荧光技术，对肾脏病的病理诊断提供了重要帮助。肾组织中HBV-Ag的检测主要采用间接免疫荧光法，即先用鼠抗人一抗与HBV-Ag反应，形成复合物，然后用荧光素标记的羊抗鼠二抗与复合物反应，发出荧光，在荧光显微镜下观察。目前实验室免疫荧光的检查主要是通过冰冻切片组织和石蜡切片组织来完成。冰冻切片免疫荧光具有操作时间短，步骤简单，组织抗原保护好等优点[7]。但是冰冻间接免疫荧光染色要求实验人员做到：(1)切割后的新鲜肾组织要迅速放入含有生理盐水的一次性塑料管中，随后放至冰冻切片机内，进行包埋切片；(2)免疫荧光检查的肾组织应避免接触任何固定液；(3)推荐使用厂家的OCT包埋剂，不要使用普通胶水代替；(4)切出大面后要在显微镜下观察有无肾小球，如果难以确认，可以将切片放入苏木素中几秒钟后观察，确认切片内有肾小球后重新切片。冰冻切片间接免疫荧光因为使用新鲜肾组织的原因，没有受到常规固定液的影响，结果的准确性和灵敏度比较可靠，所以临床实验室应多使用此方法。但是冰冻切片机和荧光抗体费用较高，使基层医院在使用上有所限制。

石蜡切片免疫荧光应用较少，作为冰冻切片无肾小球时的补救措施。但是由于肾组织在常规固定中使用的是10%的甲醛，甲醛固定的石蜡切片可以使肾组织内的蛋白质交联,抗原决定簇被封闭，导致假阴性。所以必要的抗原修复对于石蜡切片免疫荧光的成功具有重要意义。有研究报道，石蜡切片胰酶抗原修复方法与冰冻切片免疫荧光在检测肾组织HBV-Ag取得相似的效果[8]。彭卫华等[9]选择HBV-GN、 红斑狼疮肾炎、 IgA肾病，比较了几种抗原修复法的异同，结果显示胃蛋白酶修复效果好。张岚等[10]比较了石蜡切片与冷冻切片的免疫荧光染色的异同，得出经过胃蛋白酶修复过的石蜡切片在关于疾病诊断判读上没有区别，只是显色强度上稍微弱于冰冻切片。有学者提出，高温高压修复也可以用于肾组织HBV-Ag的检查，但是要注意高压锅加热修复可能导致组织破碎，尤其像肾活检这样的小组织[11]。这些相关性研究或许可以在HBV-Ag的检测时提供帮助，但是鉴于石蜡切片免疫荧光所做的研究较少，具体效果还有待证实。

2免疫组化法

免疫组化法作为实验室检测HBV-Ag的另一种重要方法，检测HBV-Ag主要是应用免疫酶染色法，即用酶标记特异性的抗体，待酶标抗体与抗原反应形成免疫复合物后，加入底物显色，进行镜检。目前实验室多采用Dako公司推出的二步法免疫组化技术-EnVision法，相对于SP、ABC等方法，要敏感很多，定位比较好、比较省时[12]。随着免疫组化的自动化，许多实验室目前都配有全自动免疫组化机，但是由于全自动免疫组化机所使用的抗原修复大多为EDTA和柠檬酸，这在石蜡切片HBV-Ag检测应用还没有大量试验进行验证，所以应该持怀疑态度。免疫组化染色涉及不同抗原的修复方法选择、不同厂家抗体效价、人为因素等缺点,使免疫组化技术的不确定性增多。伴随着试验仪器的发展和试验人员知识提高，一些改良的免疫组化方法取得了较好的效果。石成钢等[13]研究了冰冻切片免疫荧光和石蜡切片免疫组化的比较,HBV-Ag阳性率相近，改良组化为67.5%，荧光法为72.5%。

3核酸分子检测方法

HBV感染人体后，致病和传播主要在HBV-DNA。HBsAg和HBV-DNA作为HBV的外壳和核酸，检出HBsAg说明HBV感染了人体，但是不代表有传染性。HBV-DNA阳性则说明HBV在人体复制和有传染性。共价闭合环状DNA (cccDNA)代表HBV-DNA正在复制，是复制过程中RNA的直接模板,它的检出相比HBV-DNA更能说明病毒复制。已知细胞内持续 HBV 感染以核内cccDNA的存在为特征,HBV cccDNA的检测对研究HBV-GN致病机制和评价抗病毒药物的疗效等方面具有重要意义。1983年，Hogan等[14]发现，HBV cccDNA和HBsAg存在于鸭的肾组织中，证明HBV能在肾组织复制和翻译。Toplu等[15]研究抗病毒药物对血液HBV DNA和组织细胞内的HBV cccDNA的效果，得出拉米夫定对清除HBV cccDNA作用不大，所以检测HBV cccDNA在临床监测HBV疾病发展和用药效果方面是非常有必要的。目前HBV核酸分子的检测主要包括聚合酶链反应(PCR)、原位杂交技术、Southern-blot等方法检测。

3.1PCR肾组织HBV的核酸PCR检测技术是在新鲜肾组织或石蜡包埋肾组织中提取到目的DNA后,直接用PCR仪扩增后检测。PCR已比较成熟,目前实验室多采用荧光定量PCR检测,标准化操作流程见参考文献[16]。当然也要注意实时荧光定量PCR也有不可忽视的缺点，在检测步骤方面对于目的模板的制备，使用不同方法对于DNA的提取，扩增时反应条件的掌握及对PCR仪器的熟知等，这些方面都对检测提出了较高的要求。姜国涛等[17]报道用巣式PCR检测HBV-DNA阳性率为53．8%,免疫组化检测HBsAg阳性率为48.1%。证实了肾组织中核酸标志物的阳性率高于抗原标志物的阳性率。Mccourt等[18]应用PCR技术检测HBV-GN患者中肾活检抽提物PCR检查HBV-DNA阳性率为76.5%。然而在行直接PCR检测新鲜或石蜡包埋的肾组织时,不能排除血液中 HBV污染[19]。王祝娟等[20]采用实时荧光定量PCR对患者肝组织内的cccDNA进行了检测,然而在判读结果中因该考虑到酶处理对象时导致HBV cccDNA减少这一因素。

3.2原位杂交原位分子杂交法是检测肾组织中HBV DNA或RNA的另一方法。将经过适当处理的肾组织切片，与放射性物质或生物素标记的HBV DNA探针进行核酸杂交，载玻片光乳剂中杂交HBV-DNA或RNA，在放射核素显像图中呈黑色颗粒，可发现HBV感染的肾细胞。具体步骤可见参考文献[21]。原位杂交的优点是既可检测少量DNA,又可判断肾组织中HBV感染细胞的分布状况。在 HBV-GN 患者的肾组织中检测到 HBV 核酸分子,说明HBV 在肾组织中存在并且复制。然而用原位杂交检测 HBV DNA,国内以往均获阴性结果。原位杂交方法也有内在的缺点，例如不能够精确定量核酸分子，在探针选择、标记、浓度和杂交的时间和温度上都有严格的要求，组织内源性酶的影响等这些因素使它在临床应用受到了考验[22]。

3.3Southern印迹杂交Southern印迹分子杂交法适合用于区分整合于肾组织细胞的HBV-DNA和未整合的游离HBV-DNA，并可显示病毒复制中的中间产物序列，原理是肾细胞中DNA被一定的限制核酸酶切割，降解为一些小片段，后者通过琼脂凝胶电泳按相对分子质量大小分离开，将其移至硝化纤维素膜或尼龙膜上，变性后再与放射性物质标记的HBV-DNA探针一起孵育，二者结合后的含HBV-DNA片段在放射核素显像图上呈黑带。应用 Southern印迹杂交在肾组织中见到整合型 HBV DNA,但无法提示HBV DNA在细胞内的定位。

随着实验室技术的不断发展，有很多学者也运用其他方法检测HBV核酸分子，取得了不错的效果。张爱平报道直接原位 PCR检测 HBV DNA阳性信号较原位杂交更为清晰。张静等[23]报道应用原位杂交结合PCR检测40例HBV-GN患者的肾组织石蜡标本，HBV mRNA检测阳性率达到80%以上,肾小管阳性率高于肾小球。应用原位杂交结合PCR检测HBV-GN患者的肾组织石蜡标本HBV mRNA检测阳性率达到95%。原位PCR始于1990年，是对细胞内目的基因片段扩增再结合原位杂交进行检测的方法，具有扩增高效性与精确定位的优点。肾组织 HBV cccDNA的检测应采用原位杂交技术和 PCR 技术。Zhong等[24]在检测肝组织中的HBV cccDNA时，针对DNA少的情况，将实时荧光PCR技术和PSAD消化、滚环扩增及跨缺口联合，检测到一般PCR所不能检测到的范围。周益等[25]应用激光微分离技术结合PCR检测肾组织HBV DNA,检出率为54.5%,通过激光微分离肾小球和肾小管，从而清除了来自肾血管和间质中HBV DNA对结果的影响，对HBV分布在肾小球还是肾小管作出了解释。以上几种方法或许会在检测肾组织中检测HBV DNA和HBV mRNA、HBV cccDNA提供有效的检测标准。

综上所述,目前临床上冰冻免疫荧光方法检测肾组织中HBV-Ag作为诊断HBV-GN最常用的方法。肾组织HBV标志物的检测方法中,冰冻免疫荧光方法在临床实验室应用最为普遍，在肾组织HBV标志物的检测方法中,冰冻免疫荧光技术因为采用新鲜标本的原因，荧光抗体的灵敏度尚可，避免了很多影响因素,所以受到临床实验室的认可。缺点是需要肾组织新鲜,实验室配备有冰冻切片机、荧光显微镜等设备，不适合做回顾性研究;免疫组化技术由于使用的是石蜡组织，检出敏感度较低，还有技术人员熟练程度影响大,限制了它的应用。经过改良的免疫组化技术还需要更多的研究及探索才能明确其对诊断的效果。PCR、原位杂交技术、 Southern印迹杂交因为各自方法的缺点很难实现独自在检测肾组织中HBV核酸分子的可靠性与真实性。原位PCR结合了PCR和原位杂交技术的优点，对检测到有HBV的核酸分子真实性有保证,可以为临床检测服务。激光微分离技术反映病毒在肾组织的分布中具有独特优势,在提取特定肾组织部位核酸分子上可以为其他检测方法所采用。希望以上研究进展为临床HBV-GN的诊断提供一个新的有效的途径。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.029

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)11-1522-04

(收稿日期：2016-01-20修回日期：2016-03-19)