袁丽，刘芳，邬开朗，李一荣

(1.武汉大学中南医院检验科，湖北 武汉 430071；2.武汉大学生命科学学院，湖北 武汉 430072)

丙肝病毒感染对C反应蛋白表达的影响

袁丽1，刘芳2，邬开朗2，李一荣1

(1.武汉大学中南医院检验科，湖北 武汉 430071；2.武汉大学生命科学学院，湖北 武汉 430072)

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)在体内外对C反应蛋白(CRP)表达的影响。方法收集武汉大学中南医院2015年1月至2016年2月HCV感染患者标本106例和健康体检者标本110例，免疫透射比浊法检测其血清CRP水平，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV感染的Huh7.5.1细胞及其对照细胞中CRP mRNA的表达。结果HCV感染患者血清CRP水平为(8.62±5.56)mg/L，显著高于健康体检者的(1.35±0.71)mg/L，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；HCV感染的Huh7.5.1细胞中CRP mRNA的表达水平较对照细胞高，其CRP/β-actin灰度比值分别为0.31和1.5。结论HCV感染能够上调肝细胞CRP的表达。

丙型肝炎病毒；C反应蛋白；逆转录聚合酶链反应；表达

丙肝病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体，全球约1.7亿人感染HCV，50%～80%的患者会转变成为慢性感染患者，其中10%～20%的慢性感染者发展为肝硬化，每年1%～4%的肝硬化患者最终发展成为原发性肝癌(HCC)[1]。C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是一种急性时相反应蛋白，在临床感染性疾病、心血管疾病诊断、监测等方面得到广泛应用[2]。HCV感染能够引起机体的炎症反应，但目前为止，HCV对CRP表达的影响还不清楚。本研究主要通过体内外实验探讨HCV对CRP表达的调节作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集收集武汉大学中南医院2015年1月至2016年2月期间HCV感染的患者106例(HCV患者组)，其中男性62例，女性41例，平均年龄(53.2±21.5)岁。所有HCV患者抗-HCV及HCV RNA均为阳性，其诊断标准符合中华医学会制定的《丙型肝炎防治指南》。健康对照组为110例健康体检者，其中男性57例，女性53例，平均年龄(46.3±17.2)岁，所有患者均排除心、脑、肾等重要器官疾病及呼吸道病毒和其他嗜肝病毒感染。受检者均采集清晨空腹静脉血3 mL，分离后的血清于-20℃冰箱保存待测。

1.2 材料 人肝癌细胞系Huh7.5.1及HCV病毒JFH-1株感染的Huh7.5.1细胞购自中国典型培养物保藏中心(CTCC)；RNA提取试剂TRIzol R和M-MLV逆转录酶均购自Invitrogen公司；血清CRP的检测购自宁波普瑞柏生物技术有限公司；PCR扩增仪购自北京东胜创新。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 Huh7.5.1细胞在含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基，37℃，5%的CO2细胞培养箱中进行培养。

1.3.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 从TRIzolR试剂提取含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其对照细胞的总RNA，M-MLV逆转录酶反转录成cDNA，用CRP基因的检测引物5´-TCCCAA GGATTGAGTTATG-3´(上游引物)，5´-GTGGTCAAG GCTCTGTTG-3´(下游引物)进行PCR扩增，同时设立β-肌动蛋白(β-actin)作为对照[3]，PCR反应体系为25 μL，反应条件为95℃预变性5 min，然后按94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，循环25次，最后72℃延伸10 min，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 血清CRP检测 血清标本及细胞上清中CRP检测采用免疫透射比浊法。使用全自动生化分析仪ADVIA2400进行检测。实验重复3次。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组受检者的CRP血清水平比较 CRP在健康对照组为(1.35±0.71)mg/L，在HCV组为(8.62± 5.56)mg/L，两组比较差异有显著统计学意义(t=5.654，P＜0.01)。

2.2 HCV在细胞水平上调CRP的表达 与对照细胞比较，感染了HCV的Huh7.5.1细胞CRP mRNA表达水平升高，CRP/β-actin灰度比值分别为0.31和1.52。同时，感染了HCV的Huh7.5.1细胞上清中CRP含量为(11.64±0.85)mg/L，明显高于对照细胞的(2.59±0.38)mg/L，差异有统计学意义(t=5.742，P＜0.05)，见图1。

图1 RT-PCR检测CRP mRNA的表达

3 讨 论

CRP是环状五球体蛋白，属于Oligomeric钙结合蛋白，相对分子质量约120 kD。表达人类CRP的基因位于染色体1q21-1q23，由5个相同的单体以非共价键构成，CRP主要由肝脏合成，在炎症、肿瘤以及急性冠状动脉综合征患者中显著升高[2]。

乙肝病毒(HBV)和HCV感染机体后均引起肝脏的炎症反应，研究表明，乙肝病毒能够上调CRP的表达[4]。为探讨HCV对CRP的调节作用，在本研究中，我们检测了HCV患者及健康对照组CRP的血清学水平，发现HCV患者血清CRP水平显著高于健康对照组，证实了丙肝病毒在体内对CRP具有上调作用。进一步采用RT-PCR检测了HCV病毒感染的Huh7.5.1细胞和及其对照细胞中CRP的表达差异，结果显示，HCV病毒感染的Huh7.5.1中CRP的mRNA含量明显高于对照细胞，且HCV感染的Huh7.5.1细胞上清中CRP的表达水平显著高于对照细胞，表明HCV能够在体内上调CRP的表达。

HCV本身不具有肝细胞毒性，宿主的免疫因素对HCV感染的不同结局起到决定性的作用。HCV可触发机体的固有免疫和适应性免疫系统，造成免疫介导的肝损伤，临床表现为慢性肝炎、肝硬化和肝癌等。细胞因子将固有免疫和适应性免疫连接起来，在免疫应答的启动与调节中扮演重要角色。研究表明，多种白细胞介素与HCV的感染和致病密切相关，包括白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-23和IL-27等[5-7]。其中，IL-6是一种重要的炎症细胞因子，也是CRP基因表达的主要调控因子，可在转录水平上诱导肝细胞合成CRP，且这一作用可被IL-1β加强[8]。研究表明，HBV通过HBV x蛋白的反式激活作用上调IL-1β和IL-6基因的表达[9]，进而促进CRP的合成和分泌。因此，我们推测，HCV也可能是通过上调IL-1β或IL-6而间接上调CRP基因的表达。

总之，本研究通过体内外实验证实了HCV能够上调CRP的表达，但HCV调节CRP表达的具体分子机制尚待进一步研究。

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Effect of hepatitis C virus infection on the expression of C-reactive protein.

YUAN Li1,LIU Fang2,WU Kai-lang2, LI Yi-rong1.1.Department of Clinical Laboratory,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA; 2.College of Life Sciences of Wuhan University,Wuhan 430072,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of C-reactive protein(CRP)in vitro and in vivo.MethodsAtotal of 106 samples of HCV infected patients and 110 samples of healthy individuals in Zhongnan Hospital of Wuhan University from January 2015 to February 2016 were collected.Serum CRP levels were measured by immune transmission turbidity method.The expression of CRP mRNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV and control cells was measured by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsSerum CRP levels were(8.62±5.56)mg/L in patients with HCV infection,which were significantly higher than those in healthy individuals(1.35±0.71)mg/L,with statistically significant difference(P＜0.01).The expression level of CRP mRNA in Huh7.5.1 cells infected with HCV was significantly higher compared with that in control cells,and the gray ratio of CRP/beta-actin was 0.31 and 1.5 respectively.ConclusionHCV infection can upregulate the expression of CRP in liver cells.

Hepatitis C virus;C-reactive protein;Reverse transcription polymerase chain reaction;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2016）18—2932—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.18.003

2016-04-15)

国家自然科学基金（编号：31270206）

李一荣。E-mail：liyirong838@163.com