练继文

·实验研究·

胃肠转流术治疗2型糖尿病调整葡萄糖代谢的机理研究

练继文

胃转流术在2型糖尿病患者的临床治疗上取得了很好的效果,但是具体的机制目前仍然没有研究透彻,因此很多学者根据患者的表现和机体表现对手术的机制提出了各自的看法。本研究旨在探讨胃肠转流术治疗2型糖尿病的机理,研究表明下丘脑瘦素敏感性是机体葡萄糖代谢平衡调控的重要因素。胃肠转流术后血糖降低发生在术后24 h,同时伴随血清瘦素水平的下降,提示机制与瘦素的靶器官-下丘脑的瘦素敏感性有重要关联。

胃肠转流术；2型糖尿病；瘦素

糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,是由遗传和环境因素的复合病因引起的临床综合征。虽然经过了大量的研究,但糖尿病的发病机制仍然没有完全阐明。糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病。其中80%～90%是2型糖尿病。对于糖尿病的疗法,主要还是药物、饮食调节和运动治疗。然而对于不能有效控制饮食或是完全靠胰岛素的患者上述疗法并不能带来理想的治疗效果,此时,一种新型的疗法——胃肠转流术为广大患者带来了福音。

胃肠转流术创始于国外,已经有20年历史。该手术目前被定位为是自人们认识糖尿病以来最有治愈前景的新疗法。手术的主要原理是控制饮食和减低患者对食物的吸收,手术过后糖尿病患者的血糖水平会大大降低,然而对于手术调节血糖的机制至今仍然不清楚。

1 材料与方法

1.1 材料 ①Goto-Kakizaki(GK)2型糖尿病大鼠,鼠龄2～3个月。②正常Wistar大鼠,鼠龄2～3个月。③瘦素受体敲除Zucker Fatty (fa/fa)大鼠,鼠龄2～3个月。所有动物都选择雄性,按下述实验分组实施不同手术。应用2%的isoflurane吸入麻醉。手术组实施传统的胃空肠Roux-en-Y吻合术,术后特别注意饮食及水电平衡,注意伤口护理,供流食10 d,后进软食。

1.1.1 实验动物分组 GK糖尿病大鼠组(80只)。胃肠转流手术组：实施胃肠Roux-en-Y转流术。开腹手术组(sham)：仅切开腹壁进入腹腔,不进行胃肠Roux-en-Y转流术。非手术动物组：同笼相同食物饲养,不给予任何干预措施。正常Wistar大鼠组：80只,分组同上。瘦素受体敲除组：24只,分组同上。

1.2 实验方法

1.2.1 应用微导管泵技术特异性刺激下丘脑,观察手术后外周葡萄糖代谢指标的变化情况。

1.2.1.1 置管 应用GK 2型糖尿病大鼠和正常Wistar大鼠,按以上分组。于胃转流手术1周后,应用ketamine(87mg/kg)和xylazine (11mg/kg) 腹腔注射麻醉。留置导管于第三脑室,以下是大鼠脑立体定位装置数据(from bregma: anterior-posterior; +0.2mm,dorsal-ventral；9.0mm,medial-lateral; 0.0 directly on the midsagittal suture),置管3周后,开始实验。

1.2.1.2 刺激试验 动物禁食(自由饮水)48 h后,以上各组动物分两组处理。吸入麻醉后,一组连续滴注葡萄糖,一组滴注生理盐水对照。控制血糖在8mmol/L水平滴注过程4 h。相同的方法,按同样滴速连续灌注瘦素(2.5～5.0 ng/ml)和2-DG(2-Deoxyglucose-阻断葡萄糖代谢产生无葡萄糖代谢信号效应)(15 mM)。

1.2.1.3 观察指标和检测方法 以上试验每30分钟取全血150ml观察血糖浓度(葡萄糖仪),制备血清检测血瘦素、胰岛素,胰高血糖素水平、胰高血糖素样多肽(GLP-1)、葡萄糖依赖的胰岛素样多肽(GIP)(RIA 放免法)糖化血红蛋白、(RIA放免法)。相当于进行葡萄糖、胰岛素和瘦素耐量试验(敏感性分析)。同时检测标志肝糖异生、糖原分解的门户酶：葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PEPCK的表达［1］。

1.2.2 胃转流手术后下丘脑瘦素作用对机体葡萄糖代谢平衡调整作用观察。

1.2.2.1 应用GK 2型糖尿病大鼠和正常Wistar大鼠,按以上分组。①营养摄食行为学观察。从术后第1天起各组动物改单笼饲养,每日进行大鼠的体重、摄食量测量。并观测动物在禁食24 h后和腹腔注射2-DG(500mg/kg)后30 min、1、2 h的摄食量(观察手术和非手术动物下丘脑调节功能的变化)。②实验观察和检测方法。观察手术后外周葡萄糖代谢的变化规律以及和相关调节因子下丘脑调节指标及脂代谢的相关关系。术后每日测量动物的血糖水平；每3天取全血100ml(制备血清检测血瘦素、胰岛素、胰高血糖素水平、胰高血糖素样肽(GLP-1)、胰岛素样生长因子(IGF-1)葡萄糖依赖的胰岛素样多肽(GIP)(RIA 放免法)糖化血红蛋白、氢化考的松、游离脂肪酸、甘油三脂水平(ELASA酶标法)；术后2周或1、3、6个月进行葡萄糖,胰岛素和瘦素耐量试验,动物禁食24 h,腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)分别于禁食前、注射前、注射后15、30、60、120、180 min取全血100ml(测量血葡萄糖、胰岛素和瘦素水平)。

观察手术后葡萄糖代谢平衡调节的规律及其和全身葡萄糖调节因子的关系。于术后3 d、1、2周、1、3、6个月处死动物。分别取全血,各部位脑组织、肝、胰腺、胃、十二指肠、空肠组织、腹内脂肪组织等,于-80℃冰箱保存。其中,下丘脑等组织做如下实验观察：①提取RNA和蛋白质,RNA转cDNA,观察基因、蛋白水平表达。观察瘦素受体、胰岛素受体、葡萄糖激酶、神经葡萄糖通道1(GLUT1)、CtBP、Glycine Receptor,Nuclear Receptor等mRNA的表达(RT-PCR)和细胞内传导通路中葡萄糖和瘦素相关转录因子(未磷酸化的蛋白)JAK2、Sock3、PI3K、Stat3、PKC的蛋白表达水平,并将应用相关显著变化因子的拮抗剂进行验证。找出细胞内传导通路的关键点。进行中枢机制探讨。相关抗体国内均可购买。②组织形态学观察: 下丘脑组织切片做免疫组化共聚焦显微镜观察瘦素受体、JAK2、Sock3、PI3K、STAT3、PKC 等的表达。由于肝脏胰岛素受体敏感性,决定循环瘦素受体并决定外周瘦素的敏感性,本实验将进行肝脏胰岛素受体检测。肝脏、胰腺、肌肉组织和外周脂肪组织切片,做免疫组化共聚焦显微镜观察胰岛素受体的表达,得出外周胰岛素拮抗改善的证据。

1.2.2.2 最后将应用瘦素受体敲除的大鼠实施胃肠转流手术进行上述实验。预期手术不会改变该大鼠的糖尿病样病理特征。可以从反面证实下丘脑瘦素的作用在调整糖代谢中的重要性。

1.2.3 肠道-下丘脑—术后降糖调节环路的机制研究。应用术后2周～1个月的各组动物,提取胃、十二指肠、空肠黏膜和下丘脑组织的RNA(TRIzol法 Invitrogen)及蛋白质溶解液Lysed buffer,包括20mm MOPS(pH 7.0),2 mM 乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA),5 mM 乙二胺四乙酸(EDTA),0.5% Triton X-100,5 (M Pepstatin A)。进行基因和蛋白芯片分析。并根据情况进行蛋白质谱分析,以找到作用在下丘脑的特异性消化道信号。

1.3 观察指标 观察治疗前后GLP-1、IGF-1水平变化情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 手术前,大鼠GLP-1水平为(0.13±0.02)ng/100ml,术后36周GLP-1水平增加至(2.46±0.41)ng/100ml,差异有统计学意义(P＜0.05)。手术前,大鼠IGF-1水平为(571.25±59.31)ng/ml,术后36周IGF-1水平增加至(625.59±31.32)ng/ml,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 治疗前后GLP-1和IGF-1激素水平比较(±s)

表1 治疗前后GLP-1和IGF-1激素水平比较(±s)

注：与术前比较,P＜0.05

指标 术前 术后36周GLP-1水平(ng/100ml) 0.13±0.02 2.46±0.41 IGF-1水平(ng/ml) 571.25±59.31 625.59±31.32

2.2 手术前GK大鼠血糖水平为(8.5±1.0)mmol/L,手术后36周为(5.0±1.0)mmol/L,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 手术前GK大鼠瘦素水平为(0.60±0.05)μg/L,手术后36周为(0.40±0.05)μg/L,差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 胃肠转流手术前后下丘脑调节机体葡萄糖代谢平衡的作用。本研究应用微导管泵技术直接置管于手术和非手术大鼠的下丘脑,应用葡萄糖、瘦素和葡萄糖代谢抑制剂(2-DG)作用于下丘脑,观察比较两组大鼠外周血糖代谢平衡指标的不同变化,证明下丘脑神经内分泌调节变化是由胃肠手术特异引起。为手术降糖机制中的神经内分泌调节假说提供直接证据。

3.2 胃肠转流手术后下丘脑的瘦素效应和敏感性对葡萄糖代谢平衡的调节机制研究。在确立下丘脑神经内分泌调节在手术降糖机制中作用的基础上,进一步行胃肠转流手术和非手术大鼠下丘脑的瘦素效应和瘦素受体敏感性的观察,并探讨葡萄糖和瘦素细胞内信号传导关键作用点的表达变化。

3.3 引发中枢改变的上消化道特异性信号及其传导分析。为进一步探明手术后肠道-下丘脑-降低血糖的特异性信号及其中枢作用机制,应用蛋白质谱分析,基因蛋白芯片等方法对手术及非手术胃、十二指肠、空肠黏膜和下丘脑营养调节中枢的基因和蛋白的改变进行分析、筛选,鉴定出引发中枢改变的上消化道特异性信号及其作用机制,提供其对下丘脑作用的直接依据［2-4］。

目前人们进行了以下两方面的研究［5-7］：①血糖的中枢神经内分泌调节。②机体的能量代谢和葡萄糖代谢平衡受下丘脑调控。包括：感受外周激素和相关营养信号(如瘦素、胰岛素、葡萄糖、胃分泌的Ghrelin、近端结肠分泌的PYY等),调控机体的能量摄入和消耗也控制体内葡萄糖代谢产物的产出,以维持能量平衡并维持血糖水平在一个狭窄的正常范围。

［1］章勇,陈宗祐,朱江帆,等.胃转流手术治疗Ⅱ型糖尿病的实验研究.中国临床医学,2006,13(6):960-962.

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［4］陈伟杰,胡三元,张光永.胃大部分切除术对非肥胖II型糖尿病的治疗作用.腹腔镜外科杂志,2009,14(3):211-214.

［5］陆付耳,冷三华,屠庆年,等.黄连解毒汤与黄连素对2型糖尿病大鼠葡萄糖和脂质代谢影响的比较研究.华中科技大学学报：医学版,2002,31(6):662-665.

［6］文重远,吴勇,李燕,等.2型糖尿病大鼠心肌葡萄糖转运体4的变化及其对葡萄糖和脂肪酸代谢的影响.中华医学杂志,2005(21):1460-1463.

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Research of mechanism of gastrectomy bypass in the treatment of type 2 diabetes mellitus and glucose metabolism adjustment

LIAN Ji-wen.Guangzhou City Baiyun District Red Cross Hospital,Guangzhou 510545,China

Gastrectomy bypass provided excellent effect in clinical treatment for type 2 diabetes mellitus patients,while its specific mechanism was still in need of further research.Various opinions were presented by scholars,according to manifestations and vital signs in patients.This study is aimed at investigating mechanism of gastrectomy bypass in the treatment of type 2 diabetes mellitus,and its research showed sensibility of hypothalamic leptin as an important factor in balance glucose metabolism adjustment.Decreased blood glucose occurred in postoperative 24 h after gastrectomy bypass,along with reduced serum leptin level.These showed important correlation between mechanism and sensibility of hypothalamic leptin,as the target organ of leptin.

Gastrectomy bypass; Type 2 diabetes mellitus; Leptin

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.05.226

2015-08-26］

广东省医学科研基金课题(项目编号：A2013564)

510545 广州市白云区红十字会医院