胡桂萍， 石旭平， 张国彪， 杨 广， 方雅君， 黄琼瑶

(1.江西省桑蚕茶叶研究所， 江西 南昌 330020； 2.福建农林大学 应用生态研究所， 福建 福州 350003)

茶渣蛋白提取工艺条件的优化

胡桂萍1,2， 石旭平1， 张国彪1， 杨 广2*， 方雅君2， 黄琼瑶2

(1.江西省桑蚕茶叶研究所， 江西 南昌 330020； 2.福建农林大学 应用生态研究所， 福建 福州 350003)

为实现茶渣副产物资源的综合利用，提高茶渣蛋白提取率，用碱浸提法提取废茶渣蛋白，通过单因素试验分析不同提取温度、NaOH浓度、提取时间和液固比对茶渣蛋白提取得率的影响。并在单因素筛选试验的基础上，运用Design Expert 8统计分析软件，设计4因素5水平响应面试验对提取温度、NaOH浓度、提取时间和液固比进行优化。结果表明：茶渣蛋白的最佳提取条件为提取温度50℃、NaOH浓度0.1 mol/L、液固比45∶1、提取时间4 h；在该条件下，茶渣蛋白提取得率为58.94%。

茶渣； 蛋白； 提取工艺； 响应面试验

茶叶含有大量生物活性物质成分，具有止渴、清神、消炎解毒等功效，因此被公认为健康饮料。据统计，每天全世界茶饮料的消费量超过30亿杯之多。我国是最大的产茶国且国内的茶叶深加工产业化程度高，已有规模的茶饮料生产企业约近百家，如康师傅，娃哈哈等品牌。但随着茶叶深加工的发展，深加工产生的副产品数量巨大，仅茶渣每年就有16万t以上。这些废渣一般堆放在工厂外或者直接丢弃城郊，不仅占用大量的土地，长期堆放容易霉变等反应滋生不良气味，污染大气和环境[1-3]，随着十二五规划提出国家对节能减排政策的加强，如何处理这些茶渣已成为茶叶深加工厂家首先要解决的环境难题。

茶蛋白是茶叶重要功能物质的组成成分，其含量约占茶叶干重20%～30%，种类丰富，而且绝大部分为非水溶性蛋白质，约占茶叶总蛋白量的95%[4]。一般而言，茶叶经冲泡后进入茶汤的蛋白质很少，只占茶叶蛋白质总量2%左右，绝大部分非水溶性蛋白质均残留在茶渣中。茶叶中的内含物质如茶多酚、茶氨酸等虽然经过深加工处理被提取出来，但是提取率低，因此茶渣中还有很多可以被利用的有效成分，经对提取过茶多酚和茶氨酸后的废茶渣检测分析发现，茶渣中茶蛋白含量达50%以上。有研究显示，茶蛋白具有降血脂、消除自由基、抗突变等营养保健功效[5-6]。而茶渣中非水溶性蛋白质由于结构复杂，导致提取困难。因此，通过有效途径提取茶渣蛋白，提高茶渣蛋白提取率，从而提高茶叶的经济附加值以及实现茶渣副产物资源的综合利用具有重要意义。目前，茶渣蛋白提取多采用碱浸提法[7-9]，该方法操作简单，成本低，实用性强，可利用工业化推广，但已报道的碱提取法存在提取温度过高，固液比过大等问题。笔者立足于生产实际，以茶渣提取得率、减少能耗为指标，茶渣为材料，通过单因素分析和响应面试验，优化茶渣蛋白碱浸提取的最适提取温度、pH、提取时间及固液比，以期为茶渣蛋白提取的生产应用提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

茶渣为福建大闽食品有限公司提供。

试剂：硝酸钠、苯酚、次氯酸钠、硫酸铵、氢氧化钠、过氧化氢、浓硫酸、酒石酸钾钠，均为分析纯(AR)。

仪器：低速大容量离心机(DL-5型，上海安亭科学仪器厂)，高温电炉(XY-YRL-013，上海雄义电热电器有限公司)，分析天平(FA2004，上海方瑞)，消化炉(KDN系列，杭州大材光电科技有限公司)，酶标仪(iMark680，美国Bio-Rad公司)，立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX-40BI型，上海申安医疗器械厂)，酸式滴定管，专用铝制容器等。

1.2 茶渣蛋白的提取

茶渣蛋白提取参考蔡志宁等[10]和邹小明等[11]并略做修改，采用碱浸提法，称取0.5 g发酵茶渣，按一定固液比加入20 mL一定浓度的NaOH溶液、适宜温度下恒温振荡箱碱提一定时间，过滤，取滤液。

1.3 茶渣蛋白的消化

将得到的碱提液转移入消化管中，于消化炉加热煮沸去水，浓缩至1 mL液体，加入5 mL的浓硫酸，摇匀后，设置消化炉温度220℃，消化20 min，待管内形成白色循环气流后，升温至350℃，继续消化40 min后，管内样品成深棕色，从消化炉中取出，稍凉后，加入1 mL 30%过氧化氢溶液，摇匀后，放回消化炉继续消化10 min，此时再次取出，按照颜色变化情况加入30%过氧化氢，颜色越浅，加入量越少，随后再放回消化炉消化，如此重复，直至管内液体变得透明、澄清即可取出。冷凉后定容至100 mL容量瓶中，随后转移到100 mL塑料瓶中贮存备用。并另取一空白消煮液作为对照。

1.4 茶渣蛋白的定量测定

茶渣蛋白浓度以样品中N浓度来表示，测定方法采用靛酚蓝比色法。具体方法如下：1) 通过酶标仪测定标准品在635 nm波长下测取吸光值，获得标准曲线，标准方程为A=0.743 7C+0.002 1，r2=0.999 9(其中A为吸光度，C为N标准液浓度)。2) 样品测定：吸取10 mL的N提取液，稀释定容，随后通过酶标仪上测量其在635 nm上的吸光值，并代入标准曲线求出容量瓶内N浓度，根据以下公式求得N含量：

式中：N为氮含量(mg/g)，C为计算出的N浓度(mg/mL)，VC试管内总体积(mL)，VS为测定时取用的样品提取液体积(mL)，VT为提取液总体积(mL)，P为稀释倍数，W为样品鲜重(g)。

1.5 茶渣提取条件单因素考察

以茶渣为原料，用碱性水溶液提取，分别选取碱液浓度、温度、时间、固液比4个因素考察，初始条件设置为0.5 g茶渣，固液比40∶1(w/v，下同)，NaOH溶液20 mL 0.06 mol/L，35℃恒温振荡箱，碱提时间2 h。具体方法如下：

1) 温度。固定其他提取条件(固液比40∶1，NaOH溶液20 mL 0.06 mol/L，碱提时间2 h)，分别测定30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃下的茶渣蛋白得率。

2) 碱浓度。固定其他提取条件(固液比40∶1，35℃恒温振荡箱，碱提时间2 h)，分别测定茶渣在NaOH浓度0.02 mol/L、0.04 mol/L、0.06 mol/L、0.08 mol/L、0.10 mol/L、0.12 mol/L和0.14 mol/L下的茶渣蛋白得率。

3) 碱提取时间。固定其他提取条件(固液比40∶1，35℃恒温振荡箱，0.06 mol/L NaOH溶液20 mL)，分别测定茶渣在提取时间为0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h下的茶渣蛋白得率。

4) 固液比。固定其他提取条件(提取时间2 h，35℃恒温振荡箱，0.06 mol/L NaOH溶液20 mL)，分别测定茶渣在不同固液比30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1下的茶渣蛋白得率。

1.6 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以蛋白提取量为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验，其因素水平见表1。

表1 茶渣蛋白提取响应面试验的因素及水平

1.7 数据处理

数据统计分析通过Excel数据处理，统计学分析通过DPS软件，数据采用Fisher’s LSD test方差分析，响应面分析利用Design-expert 8.0软件采用Central Composites设计方法，对提取温度，碱浓度，提取时间和固液比进行4因素5水平优化。

2 结果与分析

2.1 不同因素对茶渣蛋白提取的影响

2.1.1 温度 提取温度为30～50℃条件下，茶渣蛋白得率随提取的温度升高而升高，其中30～40℃下蛋白得率增幅较小，40～50℃下的蛋白得率增幅较大，50℃时茶渣蛋白得率最高，为77.68%。提取温度超过50℃，所提取的茶渣蛋白得率反而下降(图示)，故提取温度宜在50℃左右。

图示 不同影响因素下的茶渣蛋白得率

Fig. Extraction yield of protein from exhausted tea with different influencing factors

2.1.2 NaOH浓度 茶渣蛋白得率随着NaOH浓度的升高而升高，NaOH浓度在0.04～0.1 mol/L时，蛋白得率增加量较大；NaOH浓度在0.1～0.14 mol/L时，蛋白得率的增加量变低。从其工业化生产成本和利润角度考虑，茶渣蛋白提取的NaOH浓度可初步定为0.1 mol/L。

2.1.3 提取时间 碱提时间越长，碱提取蛋白的得率越高。其中碱提时间在0.5～3 h，蛋白得率较低，均低于40%；碱提时间在3～4 h，蛋白得率迅速增大，并于4 h时蛋白得率达到最高值，为68.38%；碱提时间超过4 h，蛋白得率开始下降。故当碱提取时间为4 h时，茶渣中蛋白提取效果较好。

2.1.4 固液比 茶渣蛋白得率随固液比增大而增大，当固液比达45∶1后，增加幅度不大。在实际工业生产中，低固液比能够降低体系黏度，加快传质过程，提取效果增加，但低固液比后续处理的难度加大。故综合考虑，茶渣蛋白提取的适合固液比宜在45∶1左右。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 回归模型的建立 由表2可知，茶渣蛋白响应面试验设计及各处理的蛋白得率，对其数据进行拟合回归分析，采用逐步回归的方法对设计进行优化，建立二次回归模型：

表2 响应面试验各处理的茶渣蛋白得率

Table 2 Extraction yield of protein in the response surface experiment of extracting protein from exhausted tea

处理Treatmentx1x2x3x4蛋白得率/%Proteinyield122-2253．552000-436．003-22-2251．604000458．805222-246．206-2-2-2-232．1072-22-238．7080-40035．40922-2-245．7510400039．7511-2-2-2232．7012000058．20132-2-2251．1514-22-2-249．2015-2-22-240．8016000055．2017-222-255．0518000055．6519000057．60202-22248．9021000059．1022000059．5523222256．8524040053．85252-2-2-241．8526-2-22244．8527004049．5028-222266．4529-400048．603000-4053．55

范围内，各因素对结果的影响排序为x4>x2>x3>x1。

2.2.2 优化组合与模型验证 为得到茶渣蛋白最佳提取工艺条件，将所得到的回归方程分别对各自变量取一阶偏导等于零可得到一个四元一次方程：

57.24-7.58x1-3.13x2-2.70x3+1.22x4=0

62.99-3.13x1-6.36x2+0.56x3+0.51x4=0

58.88-2.17x1+0.56x2-2.92x3+1.01x4=0

61.80+1.22x1+0.52x2+1.01x3-4.98x4=0

求解方程组，可到模型极值坐标为x1=0.66，x2=1.7，x3=-1.26，x4=-0.55相当于提取温度50℃，碱浓度0.1 mol/L，提取时间4 h，固液比45∶1，求得茶渣蛋白提取得率最大预测值为59.21%。用上述得到的最优提取条件进行验证试验，得到茶渣蛋白实际提取得率为(58.94±1.03)%，与预测值59.21%有良好的拟合性，说明模型具有有效性，此优化组合有效，得到的优化组合为茶渣蛋白提取的最优条件，具有实际指导意义。

表3 回归方程系数及其显著性检验

注：1)r2=0.9212，Adj-r2=0.8476, 2) ***为差异极显著(p<0.001)；*为差异显著(p<0.05)

Note：1)r2=0.921 2，Adj-r2=0.84 76, 2) *** and * indicated significant levels ofp<0.001 andp<0.05 respectively.

3 结论与讨论

废茶渣中含有的粗蛋白80%以上为分子量很大的谷蛋白，谷蛋白分子间通过二硫键和疏水基团进行交联和凝聚，直接影响到蛋白的提取和分离，严重限制了茶渣蛋白的资源化利用[19]。茶渣蛋白提取随温度的升高而下降，温度高于50℃后，蛋白容易高温变性凝聚，蛋白质溶出效果降低，从而使蛋白提取效果下降[12]。试验采用响应面法获得茶渣蛋白提取最适温度50℃，有利于茶渣蛋白的提取，这与沈莲清等的试验研究结果一致[13]。另外，本研究得到茶渣蛋白提取最适碱浓度为0.1 mol/L，与已报道的相关研究相比，该工艺采用较低的碱液浓度，不仅大大降低生产成本，且提高提取蛋白的得率。碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键具有破坏作用，并可使某些极性基团发生解离[14]，使蛋白质表面分子具有相同的电荷，对蛋白质分子具有增溶作用，从而导致蛋白结构不稳定，引起蛋白质变性，产生有毒物质，或部分蛋白质水解，反而使得率降低[15]。倪星虹[16]的试验结果也表明茶渣在NaOH浓度为0.1 mol/L时，蛋白提取率最高。张晓辉[7]、王忠英[8]和李娟等[9]的研究中也采用了较低的碱液浓度，但提取温度高，且提取率均不佳。蔡志宁等正交组合优化茶渣蛋白碱提取的条件得到茶渣蛋白提取最优固液比1∶8、时间60 min、pH 11、温度60℃，但该条件下蛋白的提取率低，仅为21.89%。而毛银等采用正交试验也获得茶渣蛋白碱提取法最优提取条件并获得较高的蛋白得率77.35%，但其提取温度80℃过高，碱液浓度0.3 mol/L偏高，均容易导致茶叶中蛋白的变性，严重影响提取蛋白的质量和产量，不利于推广应用[17]。另外，也有报道通过加酶提取茶渣蛋白[11,18-19]，虽提取效能增加，但存在成本过高，不利于工厂化推广。本研究采用中心组合方式优化得到茶渣蛋白碱液提取最佳组合工艺，提取温度50℃、NaOH浓度0.1 mol/L、液固比45∶1、提取时间4 h，提取温度适宜，碱液浓度适宜，固液比和提取时间适中，具备工业生产的意义，同时茶渣蛋白得率可达59.89%，该工艺在实际生产应用上具有优越性。

[1] 罗红玉,黎星辉,郁 军.茶渣回收利用研究现状[J].福建茶叶,2010(7):8-12.

[2] 傅志民,吴永福.废弃茶渣综合再利用研究进展[J].中国茶叶加工,2011(1):17-20.

[3] 张小琴,黄昭密,郑思芳,等.茶渣之再利用研究[J].福建茶叶,2012(1):14-16.

[4] 安徽农学院.茶叶生物化学[M].2版.北京，农业出版社，1988.

[5] 活 泼,黄光荣,张晓辉,等.非水溶性茶叶蛋白降血脂作用的研究[J].茶叶科学,2005,25(2):95-99.

[6] 李 燕,蔡东联.茶蛋白液预防辐射引起的突变效应[J].癌变·畸变·突变,2001,13(1):32-35.

[7] 张晓辉,章克昌,活 泼,等.非水溶性茶蛋白的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2005,26(3):64-67.

[8] 王忠英.茶叶中蛋白的提取及理化性质的研究[D].杭州:浙江工商大学,2006.

[9] 李 娟.非水溶性茶叶蛋白提取及理化性质研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2006.

[10] 蔡志宁,王春燕.茶渣蛋白提取工艺研究[J].茶叶科学,2008,28(4):309-312.

[11] 邹小明,谢 骞,朱立成,等.茶叶蛋白的提取工艺研究[J].江苏农业科学,2007,(1):169-171.

[12] 李运罡,李梦琴,张 剑,等.响应曲面法提取玉米谷蛋白工艺优化研究[J].粮食与饲料工业,2008(9):24-25.

[13] 沈莲清,黄光荣.茶渣中蛋白质的碱法提取工艺研究[J].中国食品学报,2007,7(6):108-112.

[14] 王文高.早籼稻及碎米转化为低过敏性蛋白和缓释淀粉的研究——低过敏性大米蛋白质的研究[D].无锡:江南大学,2001.

[15] 江志炜,沈蓓英,潘秋琴．蛋白质加工技术[M].北京,化学工业出版社,2003.

[16] 倪星虹.茶渣提取蛋白及饲料化利用的初步研究[D].南京:南京农业大学,2011

[17] 毛 银,王 彬,朱科学,等.碱法提取茶渣蛋白工艺研究[J].食品研究与开发,2013,34(14):36-38.

[18] 周绍迁,徐 炎,郭洪涛,等.茶渣蛋白的提取、酶解及其作为饲料添加剂的应用研究[J].饮料工业,2011,14(12):10-14

[19] 靳伟刚,张 洋,罗鋆琳,等.茶渣资源的开发与利用——茶渣中茶叶蛋白的酶法提取和酶法水解[J].中国食品添加剂,2011(4):54-58.

(责任编辑： 孙小岚)

Optimization of Extraction Technique for Protein from Exhausted Tea

HU Guiping1,2， SHI Xuping1， ZHANG Guobiao1， YANG Guang2*， FANG Yajun2， HUANG Qiongyao2

(1.JiangxiSericultureandTeaResearchInstitute，Nanchang，Jiangxi330202; 2.InstituteofAppliedEcology,FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，Fujian350003，China)

To realize the intergraded utilization of exhausted tea and enhance the extraction rate of protein, alkali solution was adopted to extract the protein from exhausted tea. A single factor experiment was conducted to analyze the effects of extraction temperature, NaOH concentration, extraction time and liquid-solid ratio on protein extraction rate from exhausted tea. Taking the protein concentration as the main factor, a quadratic regression model of extraction conditions containing extracted temperature, NaOH concentration, extracted time and liquid-solid ratio was obtained using a four-factor and five-level test conducting on the statisstical analysis software of Design-Expert 8 which was performed according to the single-factor experiment, and the optimal condition of the extracted protein was also required. The results showed that the optimal extracted conditions were as follows: 50℃ of temperature, 0.1 mol/L of NaOH concentration, 4 h of extracted time and 45∶1 of liquid-solid ratio, and the total extracted protein yield reached 58.94% under the optimal conditions.

exhausted tea; protein; extraction technique; response surface experiment

2015-09-14； 2016-03-14修回

农业部公益性行业(农业)科研专项(201303094-08)；江西省科技支撑计划项目(20151BBA13042)

胡桂萍(1985-)，女，在读博士，研究方向：茶叶副产物资源化利用 E-mail:hugp_2007@163.com

*通讯作者：杨 广(1972-)，男，教授，从事昆虫生态及害虫综合治理 。E-mail:yxg@iae.fjau.edu.cn

1001-3601(2016)05-0220-0127-04

S38

A

加工贮藏·农产品质量

Processing and Storage·Agricultural Product Quality