刘清斌， 刘 奎， 王 军， 李 觅， 杨小龙

(1.四川理工学院 生物工程学院， 四川 自贡 643000； 2.四川国光农化股份有限公司， 四川 简阳 641400)

高效氯氰菊酯降解菌RH7的鉴定及其降解条件的优化

刘清斌1， 刘 奎1， 王 军2， 李 觅1， 杨小龙1

(1.四川理工学院 生物工程学院， 四川 自贡 643000； 2.四川国光农化股份有限公司， 四川 简阳 641400)

为探明高效氯氰菊酯降解菌RH7的种属地位及其对高效氯氰菊酯的降解率，通过分子生物学方法对菌株RH7进行鉴定，并采用响应曲面法对其降解条件进行优化。结果表明：菌株RH7属于铜绿假单胞菌属(Pseudomonassp.)，将其命名为Pseudomonassp.RH7。通过响应面模型分析，得最优降解条件为高效氯氰菊酯浓度111.7 mg/L、温度32.05℃、pH 6.88。在此条件下，菌株RH7在5 d内对高效氯氰菊酯降解率为79.46%，与所建立模型的预测值(80.83%)接近。

铜绿假单胞菌属； 高效氯氰菊酯； 降解条件

2015年4月20日提请全国人大常委会审议的食品安全法修订草案三审稿提出“国家鼓励和支持使用高效低毒低残留农药，推动替代剧毒、高毒农药产品的研发和应用，加快淘汰剧毒、高毒农药。剧毒、高毒农药不得用于蔬菜、瓜果、茶叶和中草药材”。

高效氯氰菊酯作为低毒的拟除虫菊酯类农药具有对环境相对稳定、降解速度慢的特点[1]，随着拟除虫菊酯农药广泛、大量的应用和使用时间的延长，造成菊酯类农药在农产品中蓄积或残留[2-3]。作为一种广谱杀虫剂，菊酯类农药可应用于多种果树、粮棉油、蔬菜和林木等多种虫害的防治[4-5]，与人们的生活息息相关。已有研究表明，拟除虫菊酯类农药对某些有益昆虫(家蚕、蜜蜂和赤眼蜂等)的毒性很高[6]，对人体也有较大毒害，如神经毒性、急性毒性、生殖和发育毒性等[7]。因此，消除和降低拟除虫菊酯类农药残留的污染物，提高食品和环境安全已成为人类亟待解决的问题。

微生物降解是消除环境中拟除虫菊酯类农药污染的有效途径之一。有关高效氯氰菊酯的降解菌主要在假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)和肠杆菌属(Enterobacter)等微生物种类中被发现。为丰富高效氯氰菊酯降解菌资源，笔者从土壤中筛选到的菌株RH7，采用分子生物学方法对其进行鉴定，并利用响应面法对其降解条件进行优化，以提高其对高效氯氰菊酯的降解率，为进一步利用该菌对高效氯氰菊酯农药污染的治理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

高效氯氰菊酯原药(纯度>95%，成都艾克达化学试剂有限公司)，色谱纯乙腈(东莞市乔科化学有限公司)，rTaq酶、dNTPmixture；10×Pcrbuffer(freeMg2+)、MgCl2(25 mmol/L)、引物16F27/16R1492，均购于TaKaRa公司。

D3024台式高速微量(冷冻型)离心机(大龙创新试验仪器北京有限公司)，BD-30生物显微镜(深圳市博视达光学仪器有限公司)，GZ-250-HSH恒温恒湿培养箱(韶关市广智科技设备有限公司)。

1.2 降解率测定

以接菌一定浓度高效氯氰菊酯培养液为试验样，以未接菌同浓度高效氯氰菊酯培养液为空白样，采用HPLC法测其残留量。

降解率=[(a0-a)/a0]×100%

式中：a0为空白样中高效氯氰菊酯的残留浓度，a为试验样中高效氯氰菊酯的残留浓度。

1.3 降解菌的16SrDNA鉴定

1.3.1 细菌总DNA的提取

1) 将筛选得到的菌株活化后接种到LB固体培养基上，28℃恒温培养24 h后，挑取少量菌体到灭菌的1.5 mL EP管中。

2) 加入500 μL CTAB缓冲液和50 μL蜗牛酶(100 mg/μL)，37℃，225 r/min震荡2 h。

3) 加入10%SDS 100 μL，接着在65℃水浴15 min和-80℃冷冻20 min，反复冻融3次之后，加等体积氯仿、酚、异戊醇(25∶24∶1，v/v/v)震荡1 min，静置10 min，10 000 r/min离心10 min。

4) 取上清液450 μL到新的EP中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，常温静置1 h后，20℃，10 000 r/min离心20 min。

5) 弃上清液，加入1 mL 70%乙醇，静置10 min后，10 000 r/min离心15 min，弃乙醇溶液(重复洗涤2次)，在超净工作台吹干至无醇味，加入50 μL无菌双蒸水，65℃水浴1 h。

6) 琼脂糖电泳检测有无DNA。

1.3.2 16SrDNA测序及系统发育树的建立 将总DNA进行PCR扩增，扩增引物1(27F)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物2(1492R)：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系(50 μL体系)：模板DNA 2 μL，10×PCR缓冲液5 μL，MgCl2(25 μmol/L)4 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)4 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL)，加ddH2O至50 μL。

PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，35个循环；最后72℃温育10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，进行序列测定(经上海杰李生物有限公司进行测序)。

1.4 系统发育树的构建

将测得的基因序列去除掉杂峰的部分后拼接，在Ezbiocloud上进行序列比对，筛选相似度较高(>95%)的16SrDNA序列，采用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树，通过自举分析进行置信度检测，自举系数为1 000。使用ClustalX软件进行序列比对，将DNA序列在NCBI上进行BLAST比对，构建系统发育树，并将序列提交到GenBank申请得到注册号。MEGA5.05绘制发育树。

1.5 菌株降解条件优化

综合前期单因素试验结果，选取高效氯氰菊酯浓度(A)、温度(B)、pH(C)为自变量，用Design Expert V 8.0.6软件进行响应面试验设计，选择3因素3水平的Box-Benhnken设计，试验因素水平设计见表1。其他培养条件：摇床转速150 r/min、接种量5%(v/v)、培养时间5 d、普通培养基。

表1 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的响应面试验 因素与水平

Table 1 Factors and levels for response surface of strain RH7 to degrading Beta-cypermethrin

因素Factors编码Number水平 Levels-101浓度/(mg/L)ConcentrationA50100150温度/℃TemperatureB253035pHC678

1.6 回归方程的建立

利用Design Expert V 8.0.6对响应面试验的结果进行分析，得到各个因素与高效氯氰菊酯降解率的回归方程。

1.7 高效氯氰菊酯降解率的测定

1) 样品前处理。降解试验定时取样，加入等体积的三氯甲烷，旋涡混合器上充分振荡抽提2 min，低温离心去除菌体，取下层有机相检测农药残留浓度。

2) 色谱条件。色谱柱Sepax GP-C18柱，流动相为乙腈∶水=75∶25(v/v)，流速1 mL/min，检测波长278 nm，进样量10 μL。根据标准曲线方程y=19.889x-151.06(R2=0.999 2)计算高效氯氰菊酯的降解率。

2 结果与分析

2.1 菌株RH7的16SrDNA系统发育分析

2.1.1 16SrDNA扩增结果 由图1可知，菌株RH7总DNA的扩增产物长度在1 500 bp左右，电泳条带明亮，阴性对照无条带，说明扩增效果较好，结果可信。

2.1.2 系统发育树的构建 RH7基因序列与BLAS比较，在QenBank中申请得到注册号为KT715742。从图2可知，菌株RH7与铜绿假单胞菌〔Pseudomonas aeruginosa JCM 5962(T)〕处于同一聚类分支上，分支置信度为100%，且BLAST比对结果表明，RH7与铜绿假单胞菌〔PseudomonasaeruginosaJCM 5962(T)〕的DNA序列相似度为99%，聚类分析与比对结果一致，因此可以确定该菌株属于铜绿假单胞菌属，将其命名为Pseudomonassp.RH7。

注：A为阴性对照，B为RH7扩增产物。

Fig.1 The electrophoresis of amplification products of strain RH7

图2 菌株RH7的系统发育树

2.2 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的条件优化

2.2.1 高效氯氰菊酯降解率的回归方程建立及显著性检验 通过对菌株RH7降解高效氯氰菊酯响应面试验结果(表2)分析，得到3个因素与高效氯氰菊酯降解率的回归方程：

降解率=78.63+2.74A+8.86B-1.09C+0.36AB-1.99AC+0.22BC-6.62A2-10.88B2-6.06C2

表2 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的响应面设计 试验及结果

Table 2 Response design and results of strain RH7 to degrading Beta-cypermethrin

处理TreatmentABC降解率/%Degradationrate110165．59201170．47300079．134-1-1050．6550-1-153．36600079．42700078．96800077．799-10164．621011072．341110-171．2612-11065．6013-10-162．351401-172．67151-1055．94160-1150．281700077．84

注：共有17个试验，其中12个为析因试验，5个为中心试验，以估计误差。

Note：There are 17 tests including 12 factorial tests and five center tests.

2.2.2 菌株RH7降解高效氯氰菊酯的条件优化及验证 采用Box-Behnken软件对确立的回归方程模型进行参数优化分析，得出菌株RH7降解高效氯氰菊酯的最佳条件为高效氯氰菊酯浓度111.7 mg/L、温度32.05℃、pH 6.88。在此条件下，实际测得高效氯氰菊酯降解率为79.46%，回归模型预测降解率为80.83%，与预测值比较接近，说明回归方程可真实地反应各因素对响应值的影响。

3 结论

从土壤样品中分离到一株高效氯氰菊酯降解菌RH7,采用分子生物学方法对其进行鉴定，最终确定为铜绿假单胞菌属(Pseudomonassp.)。依据响应面设计建立模型优化后高效氯氰菊酯的降解条件为高效氯氰菊酯初始浓度111.7 mg/L、温度32.05℃、pH为6.88，摇床转速150 r/min、接种量5%(v/v)、培养时间5 d，其预测值为80.83%。在此条件下，实际测得高效氯氰菊酯降解率为79.46%，与预测值相比其相对误差范围在±2%，说明该数学模型能较好预测各因素与降解率的关系。

[1] 丁海涛,李顺鹏,沈 标,等.拟虫菊酯类农药残留降解菌的筛选及其生理特性研究[J].土壤学报,2003,40(1):123-129.

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[4] 赵杰宏,赵德刚.降解残留有机农药的微生物资源研究进展[J].农药学学报,2008,10(3):260-267.

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(责任编辑： 孙小岚)

Identification of Beta-cypermethrin Degrading Strain RH7 and Its Optimization of Degradation Conditions

LIU Qingbin1, LIU Kui1, WANG Jun2, LI Mi1, YANG Xiaolong1

(1.CollegeofBioengineering,SichuanUniversityofScienceandEngineering,Zigong,Sichuan643000; 2.SichaunGuoguangAgrochemicalLimitedCompany,Jianyang,Sichuan641400,China)

Strain RH7 was identified by the molecular biological method and the degradation conditions were optimized by the response surface method to discuss species status of Beta-cypermethrin degrading strain RH7 and its degradation rate of Beta-cypermethrin. Results: Strain RH7 is identified asPseudomonassp. The optimum conditions for degrading Beta-cypermethrin include 111.7 mg/L Beta-cypermethrin, 32.05℃ and pH 6.88. The degradation rate of strain RH7 to Beta-cypermethrin reaches 79.46% within 5 d under the optimum conditions, which is close to the predicted value (80.83%) calculated by the established model.

Pseudomonas; Beta-cypermethrin; degradation condition

2015-11-10； 2016-05-07修回

刘清斌(1962-)，男，教授，从事食品安全研究。E-mail: 570877656@qq.com

1001-3601(2016)05-0201-0056-03

S481+.8

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