王丽萍，田 伟，姜孝成*

(1.湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙 410081；2.广西亚热带作物研究所，广西南宁 530001)



水稻品种(系)种子休眠特性评价

王丽萍1，2，田 伟1，姜孝成1*

(1.湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙 410081；2.广西亚热带作物研究所，广西南宁 530001)

鸣谢感谢陈良碧教授在该研究工作中提供的宝贵建议和帮助；感谢湖南师范大学植物发育与分子生物学所有老师和同学的帮助。

种子休眠是植物经过长期演化而获得的一种适应环境变化的生物学特性，具有重要的生物学意义[1]。水稻种子的休眠特性是一个重要的农艺性状，与种子质量直接相关[2]。目前，我国南方地区水稻在成熟收获季节，若遇高温阴雨天气，容易出现穗发芽现象[3]，从而降低稻米品质和种子质量。在水稻育种实践中，种子萌发整齐、发芽势高往往是一个重要的目的性状；如果水稻种子具有较强的休眠特性，将导致种子在萌发处理时难以出苗或出苗率很低，也不利于通过萌发试验进行种子纯度鉴定和质量检测，从而影响种子的销售经营。因此，人为选育快速整齐发芽的水稻品种可能是导致水稻种子休眠特性丧失的重要原因。此外，杂交水稻制种过程中，大剂量施用“920”(赤霉素)也可能对解除水稻种子休眠有促进作用[4]。为解决穗萌问题、提高种子质量，筛选和培育在成熟收获时具一定休眠特性、在播种时休眠解除而能正常萌发的水稻品种，对于农业生产和种子经营具有重要意义。

曹雅君等[5]对13 个水稻主栽品种的种子进行休眠特性研究，结果发现品种间的萌发率存在显著差异。孙君亮等[6]研究发现培矮64S 种子属于深度休眠类型，在海南春繁和湖南夏繁两地收获种子的休眠期分别为105和77 d。培两优500 和培两优288 种子的休眠期与母本培矮64S 种子差别不大。蒋家月等[7]研究发现光温敏核不育系新安S种子具有深度休眠特性，休眠期在47～62 d。石瑜敏等[4]检测了3个杂交水稻恢复系纯系的休眠特性，发现不同材料种子在同一年份同一收获季节的休眠特性不同；同一材料的种子休眠期在同一年份不同收获季节间存在差异，且同一材料的种子休眠特性在不同年度间也不同。对种子休眠的分子机制研究表明，RNA干涉水稻OsVP1的表达能够显著提高种子的萌发速率，从而导致穗发芽[8]。目前对生产上广为应用的不育系品种的休眠特性尚缺乏总体认识，对野生稻种子的休眠特性及其可开发潜力尚未见报道，OsVP1等休眠相关基因的表达是否与水稻品种(系)种子的休眠程度存在相关性尚不得而知。笔者以茶陵野生稻种子为对照，对目前生产上普遍使用的不育系品种、湖南师范大学植物发育与分子生物学实验室选育的众多水稻新资源品系的休眠特性进行评价，并对休眠相关基因OsVP1、Sdr-4和TRAB1在不同休眠程度的不同水稻品系种子中的表达量进行比较，以期为选育具有合适休眠程度的水稻品种、解决穗萌问题提供理论依据和亲本资源，为深入探讨种子休眠的分子机制提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料茶陵野生稻种子，采自湖南省茶陵县尧水乡爱里村湖里野生稻保护区；27个光温敏核不育系水稻品种和699个常规水稻新资源品系的种子，由湖南师范大学植物发育与分子生物学实验室栽培或选育。以上种子成熟收获后，部分种子立即检测其萌发能力；其余种子于室内实验台上自然风干后，于室内自然通风条件下贮藏，每隔30 d进行一次萌发率检测。

1.2试验方法

1.2.1休眠特性评价。按国家标准GB3453-95《农作物种子检验规程》测定萌发率[9]。选取各供试材料发育良好、整齐的种子300粒(每个处理100粒种子，3次重复)，在30 ℃蒸馏水中浸泡24 h后，均匀排列于垫有2层滤纸的培养皿中，加适量蒸馏水以保持滤纸湿润，加盖后置于培养箱[(30±1)℃，RH=100%]中，萌发处理10 d，统计萌发率。以胚根长度不短于种子长度且胚芽长度不短于种子长度的50%视为种子萌发。萌发率=萌发的种子数/供试种子数×100%。根据新采收种子萌发率的高低，将休眠特性分为5种类型：①极强休眠类型，萌发率≤5%；②强休眠类型，萌发率为5%～40%；③中度休眠类型，萌发率为40%～70%；④浅休眠类型，萌发率为70%～90%；⑤无休眠类型，萌发率>90%。

1.2.2种子休眠相关基因的PCR鉴定及其表达分析。从http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/About/index.html上查询获得3个与种子休眠相关的基因：①种子成熟和休眠所必须的脱落酸信号转导途径中的重要转录因子OsVP1；②水稻种子休眠和驯化调节子基因Seed dormancy 4(Sdr-4)；③既能与VP1互作也能结合ABA应答元件basic region leucine zipper(bZIP)的转录因子TRAB1。用荧光定量PCR法[10]检测它们在休眠程度不同的水稻种子中的表达差异。所用PCR引物见表1。

表1水稻休眠相关基因PCR分子鉴定所用的引物

Table 1The primers of dormancy-related genes in rice used in PCR molecular identification

基因名称Genename正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimerOSVP1CGTTCTTCATGGAGTG-GCTTCTTCTGGAGGTGGTGGTTSdr-4AGGACGAGGACGAG-GAGAGGACGTCGATGTGGACTGACTTRAB1GCTGTCAACAACAGCTC-CATACTCCGGACATCAGCCTATT

极强休眠品系(CR210，X031)、强休眠品系(X069，L025)、浅休眠品系(002，006)和无休眠品系(X019，CR202)种子DNA的提取参照CTAB法[11]，PCR扩增休眠相关基因及其产物检测按照常规方法，20 μL 反应体系：10 μL PCR Mix，正、反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL(含1 μg)，添加已灭菌的去离子水至终体积20 μL。扩增反应在Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR仪上进行。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性1 min，55～60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30个循环；反应终止在22 ℃。PCR扩增产物用TBE溶液配制的2%～3%的琼脂糖凝胶电泳，EB法显色观察，拍照。上述材料的RNA提取及休眠相关基因的表达分析参照成海兰[12]的方法，切取待测材料种子的种胚装入EP管，液氮中速冻30 min后，经过样品处理-相分离-RNA沉淀-RNA溶解几个步骤获得总RNA，用紫外分光光度法测定RNA浓度，重复测定3次；取2 μL样品进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，评价RNA的纯度和完整性。采用染料法(SYBR Green I)对OsVP1、Sdr-4和TRAB1的表达进行相对定量分析。

2结果与分析

2.1不同类型水稻品种(系)休眠特性差异

2.1.1茶陵野生稻种子在贮藏期间的休眠特性变化。由表2可知，刚采收的茶陵野生稻成熟种子具有极强的休眠特性，萌发处理10 d时萌发率为0。随着贮藏时间的延长，其休眠程度逐渐减弱，贮藏90 d后，萌发处理10 d时，萌发率可达46%。野外观察表明，茶陵野生稻种子成熟后，落在水中，浸泡数月而不腐烂，次年春天遇到适宜的温度，在水深不超过5 cm水中可正常发芽并成苗，但萌发很不整齐。因此，茶陵野生稻种子的强休眠特性可能与其生态适应性有关，可为以后培育抗穗萌的水稻新种质提供基因源。

表2不同贮藏时间对茶陵野生稻种子萌发的影响

Table 2Effect of different storage time on seed germination of Chaling wild rice

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2.1.2不同两用核不育系水稻种子的休眠特性比较。由表3可知，27个水稻两用核不育系品种中，5个品种(系)具有极强休眠特性(萌发率≤5%)，占两用核不育系品种(系)总数的18.5%，其中4个品种在萌发处理4 d时未见萌发；13个品种(系)(占48.2%)具有强休眠特性，萌发率在7%～40%；7个品种(系)(占26.0%)具有中度休眠特性，萌发率在41%～70%；光敏不育系S318具有浅休眠特性，萌发率为71%；有些品种(系)在萌发处理的第2天开始萌动，但萌发处理结束时，其萌发率都不超过71%，说明这些品种(系)种子个体间的休眠特性存在差异或严重的遗传分化；总体而言，大部分两用核不育系水稻品种(系)具有中度偏强的休眠特性。早籼温敏核不育系株1S几乎无休眠特性，新鲜成熟种子萌发处理7 d的萌发率即达到最高值93%，在生产上，该品种种子采收后，为保存其种子活力，建议低含水量、低温条件贮藏。

表3不同类型两用核不育系水稻种子的休眠特性

Table 3Determination of dormancy characteristics of rice seeds of different dual purpose genic sterile lines

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2.1.3不同水稻资源种子的休眠特性比较。699个水稻资源品系在休眠程度上存在极显著差异。具体分类见表4。

表4699个水稻资源品系的休眠特性差异

Table 4Differences in dormancy characteristics of 699 rice resources lines

休眠程度Dormancydegree品系数目Numberoflines∥个典型特征Typicalcharacteristics极强休眠Extremelystrongdormancy20萌发出现的最短时间不少于5d;萌发处理10d,萌发率不高于5%;很少出现种子发霉腐烂的现象强休眠Strongdormancy73萌发出现的最短时间不少于5d;萌发处理10d,萌发率为5%～40%中度休眠Moderatedor-mancy170多数品系种子在萌发处理1d后,即开始萌发,但萌发速率参差不齐;萌发处理10d时,萌发率为40%～70%浅休眠Lightdormancy290萌发行为类似中度休眠类型,萌发处理10d,萌发率为70%～90%无休眠Non-dormancy146种子萌发整齐、时间短,幼苗长势好;萌发处理10d,萌发率为90%～100%;这类品系如种子成熟时遇连续高温多雨天气,极易出现穗萌现象(图1)

注：A.高温多雨1 d；B.室内保湿处理3 d。Note：A.1 d of high temperature and rainy weather；B.3 d of indoor moisture treatment.图1　水稻品系YD133的穗萌现象Fig.1　Seed sprouting phenomenon of rice line YD133

699个资源品系中，浅休眠和无休眠类型共436个，占所有供试资源品种(系)的62%。反映了大多数水稻材料休眠特性偏弱，也间接反映了目前水稻种子在贮藏过程中容易失去活力的原因；但也有20个休眠特性极强的品系，部分是湖南师范大学植物发育与分子生物学实验室从育种资源品种(系)植株开花期间受野生稻串粉结实选育而来，可望作为研究和开发利用野生稻种子休眠基因的材料；同时，可用作亲本资源，培育贮藏性能好的水稻新品种。

具休眠特性的水稻种子在自然通风贮藏过程中，每隔30 d检测一次种子的萌发率，结果表明，随着贮藏时间延长，休眠特性越强的品种(系)种子达到最高萌发率(皆可达到90%以上)的贮藏时间也相应延长，无休眠特性的品种(系)其种子萌发率则在贮藏至某一时间后呈下降趋势，这与水稻种子具一定休眠特性有利于种子贮藏，无休眠种子则在贮藏过程中种子活力下降的生产实际相吻合。

2.2种子休眠相关基因表达与休眠特性的关系OsVP1、Sdr-4和TRAB1是3个已报道的与种子休眠相关的基因，PCR扩增结果表明，它们在8个不同休眠特性的水稻品种(系)中都存在(图2)。

注：M.marker；1(CR210)和2(X031).极强休眠品系；3(X069)和4(L025).强休眠品系；5(002)和6(006).浅休眠品系；7(CR202)和8(X109).无休眠品系。Note：M.marker；1(CR210)and 2(X031).Lines with extremely strong dormancy；3(X069)and 4(L025).Lines with strong dormancy；5(002)and 6(006).Lines with light dormancy；7(CR202)and 8(X109).Non-dormancy lines.图2　不同休眠特性水稻品系中OsVP1、Sdr-4和TRAB 1的PCR扩增结果Fig.2　PCR amplification results of OsVP1，Sdr-4 and TRAB 1 in rice lines with discrepant dormancy characteristics

Real-time PCR分析结果(图3)表明，OsVP1、Sdr-4、TRAB1的表达在水稻品系间存在明显差异，但并不与休眠特性的强弱成比例。OsVP1在强休眠特性品系X069中的表达量是极强休眠特性品系CR210的3倍多；Sdr-4在休眠特性相差不大的002品系和006品系中基因表达量差异较大，而在强休眠特性的L025和无休眠特性的X019中表达量几乎无差异；在具不同休眠特性的水稻品系中，TRAB1的表达量有差异，但在休眠程度相近的品系间也有差异。

注：CR210和X031.极强休眠品系；X069和L025.强休眠品系；002和006.浅休眠品系；X019和CR202.无休眠品系。Note：CR210 and X031.Lines with extremely strong dormancy；X069 and L025.Lines with strong dormancy；002 and 006.Lines with light dormancy；X 019 and CR202.Non-dormancy lines.图3　OsVP1、Sdr-4和TRAB1基因在不同特性水稻品系种子中的相对表达量Fig.3　Relative expression of OsVP1，Sdr-4 and TRAB1 in seeds of rice lines with discrepant dormancy characteristics

3结论与讨论

通过对茶陵野生稻、27个两用核不育系和699个资源品种(系)共727个水稻材料休眠特性的评价结果表明，水稻品种(系)的休眠特性存在明显差异。其中，茶陵野生稻、5个两用核不育系水稻和20个水稻资源品系具有极强的休眠特性，其新采收成熟种子的萌发率在0～5%，它们可望成为研究和开发利用水稻种子休眠基因的材料，培育贮藏性能好的水稻新品种。除株1S种子几乎无休眠外，其他两用核不育品种的种子皆表现出一定程度的休眠，这是保证种子贮藏质量的有利性状。另一方面，在699个资源品系中，浅休眠和无休眠类型共436个，占所有供试品种(系)的62.4%，反映了在水稻新品种选育过程中，新种质的休眠特性偏弱或容易丧失，田间观察发现其中有些品系容易出现穗发芽现象，会严重影响稻米品质和种子质量，也是目前水稻种子在贮藏过程中容易失去活力的重要原因。

在该研究中，刚采收的茶陵野生稻成熟种子具有极强的休眠特性，萌发率为0。而刘贵华等[13]研究表明，刚采收的茶陵野生稻种子(1997年10月22日采于庵家山普通野生稻保护地)萌发处理14 d后的萌发率为11%，造成这种差异的原因可能与茶陵野生稻种子生长发育所处的不同生态、气候、地理环境或萌发处理条件等有关。孙君亮等[6]研究表明，海南和湖南两地生产的培矮64S种子，在海南3月中旬成熟，初始萌发率低于10%；在湖南8月中旬成熟，初始萌发率达50%以上；该研究的培矮64S种子是9月下旬在湖南成熟采收的，萌发率为70%。这一现象为通过异地栽培制种的方式有效调控水稻种子的休眠特性提供了参考。此外，两用核不育系和水稻资源品种(系)种子表现出休眠特性强弱不同的连续变化类型。表明水稻种子的休眠特性存在多样性，从中选育适度休眠特性的优良品种是切实可行的。

研究表明，转录因子viviparous1(VP1)在种子成熟和休眠过程中脱落酸信号转导途径中起关键作用，它通过激活胁迫激素ABA应答基因来调控植物种子的成熟和休眠[14]。Fan等[15]在研究水稻同源基因OsVP1时发现，在冈46B 和黑B 水稻这2种极易发生穗萌的品系中，OsVP1的大部分转录产物常出现错误剪接加工；然而，在抗穗萌的品种辐恢838 和Lemont中，只有小部分转录产物会出现此种情况，因此推测水稻穗萌可能是OsVP1基因功能丧失造成的。Seed dormancy 4(Sdr-4)是一个水稻种子休眠和驯化调节子基因，有防止水稻kasalath种子穗萌而保持深度休眠的作用，导致种子萌发率下降[16]。TRAB1是结合ABA应答元件，且与VP1互作的转录因子，其本身的转录依赖于VP1和ABA诱导，从而控制植物胚胎的成熟和休眠[17]。该研究对这3个已报道的与种子休眠相关的基因OsVP1、Sdr-4、TRAB1在8个不同休眠特性水稻品系中的表达变化进行了Real-time PCR分析，结果表明它们在具有不同休眠特性的水稻品种种子中的表达存在明显差异，但不与种子的休眠特性强弱呈线性关系。

该研究结果表明，种子休眠可能存在物种或个体特异性，而且与种子生长发育所处的生态、气候等环境因素有关，在不育系新品种选育和种子生产过程中应引起重视；种子休眠的分子机制可能相当复杂，OsVP1、Sdr-4、TRAB1等单一基因可能只在某一品种或个体中起关键调控作用；要揭示种子休眠的普遍机制，可能涉及一个由遗传和生态、气候等环境因素协同作用的调控网络。

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摘要[目的]评价水稻品种(系)种子休眠特性，为选育具有合适休眠程度的水稻品种、解决穗萌问题提供理论依据和亲本资源。[方法]通过萌发试验对不同类型水稻品种或品系新鲜种子的休眠特性进行评价，并通过荧光定量PCR检测种子休眠相关基因OsVP1、Sdr-4和TRAB1在休眠程度不同的水稻种子中的表达差异。[结果]不同类型水稻品种(系)的休眠特性存在明显差异，新采收的茶陵野生稻种子不能萌发，18.5%的两用核不育系水稻品种(系)的种子萌发率不高于5.0%，13.3%的资源品系的种子萌发率不高于40.0%；OsVP1、Sdr-4和TRAB1普遍存在于不同水稻品种(系)中，且表达量差异明显，但不与休眠程度成比例。[结论]水稻种子休眠特性可通过品种改良失去或重新获得。

关键词水稻种子；休眠；OsVP1;Sdr-4;TRAB1

Evaluation of Seed Dormancy of Various Rice Varieties (Lines)

WANG Li-ping1,2, TIAN Wei1, JIANG Xiao-cheng1*(1. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, Hunan 410081; 2. Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001)

Abstract[Objective] To evaluate seed dormancy of various rice varieties(lines), and provide theoretical basis and parent resources for breeding of rice varieties with suitable degree of dormancy and solving the problem of spike sprouting. [Method] By means of germination test, the dormancy of fresh mature seeds of different types of rice varieties or lines were evaluated. Meanwhile, by fluorescence quantitative PCR method, the expression of seed dormancy-related genesOsVP1,Sdr-4 andTRAB1 were measured in seeds of different rice varieties or lines. [Result] Seeds of different rice varieties or lines exhibited remarkable difference in dormancy degree, fresh matured seeds of chaling wild rice did not exhibit germinability, the germination percentage of seeds of 18.5% dual-purpose genic male sterile lines was not more than 5.0%, the germination percentage of seeds of 13.3% resource lines for rice breeding was less or equal to 40.0%;OsVP1,Sdr-4 andTRAB1 were widely identified and showed significant difference in expression in various types of rice seeds, but did not exhibit linear relationship with dormancy degree. [Conclusion] Seed dormancy of rice varieties can be regained or weakened by breed improvement.

Key wordsRice seed; Dormancy;OsVP1;Sdr-4;TRAB1

收稿日期2015-12-07

作者简介王丽萍(1986- )，女，广西藤县人，实习研究员，硕士，从事植物发育与分子生物学研究。*通讯作者，教授，博士，从事种子生物学研究。

基金项目湖南省生态学重点学科建设项目((0713))；湖南省高校生物发育与新产品开发协同创新中心项目。

中图分类号S 330.3+3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-226-04