陈小强，李佳娜，郭依萍，张 莹*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北林业大学生物资源生态利用国家地方联合工程实验室(黑龙江)，黑龙江哈尔滨 150040；3.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040)



新鲜紫穗槐果实挥发油的化学成分·抗氧化及细胞毒活性

陈小强1，2，李佳娜3，郭依萍3，张 莹1，2*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北林业大学生物资源生态利用国家地方联合工程实验室(黑龙江)，黑龙江哈尔滨 150040；3.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040)

紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)为豆科(Leguminosae)紫穗槐属(Amorpha)植物，该属植物约有25种，主产于北美至墨西哥，我国引种紫穗槐1种，作为常用绿肥、蜜源及绿化树种在我国大部分省区均有种植[1]。紫穗槐枝条可用于编织，根、茎、叶可药用，其叶微苦、凉，具有祛湿消肿功效，其花可清热、凉血、止血，紫穗槐果实挥发油具有驱蚊止痒功效，是一种理想的天然香料[2]。此外，紫穗槐果实提取物具有抑菌作用和保肝作用，紫穗槐单方亦可应用于治烧烫伤、痈疮和湿疹[3]。植物挥发油多具有抗肿瘤、抗氧化和抑菌等生物活性[4-7]。目前有关紫穗槐的研究工作多集中在生理和生态方面的研究，化学方面的研究较为缺乏，其挥发油的化学成分虽有所报道[8-9]，但对新鲜紫穗槐果实挥发油的化学成分及其抗氧化和抗肿瘤活性研究鲜见开展。笔者利用水蒸气蒸馏法提取挥发油后，采用GC-MS法检测其成分组成；采用DPPH和β-胡萝卜素法检测挥发油的抗氧化活性，采用SRB法检测挥发油对BGC-823、A-549和HeLa等3种肿瘤细胞株的细胞毒活性，研究新鲜紫穗槐果实挥发油的化学成分、抗氧化和细胞毒活性，以期为紫穗槐的进一步研究和开发应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试材紫穗槐果实于2013年8月采自东北林业大学哈尔滨试验林场，标本经东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室张莹副研究员鉴定为豆科紫穗槐属植物紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)的果实。

1.2试剂DPPH(2, 2-联苯基-1-苦基肼基)、BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)、BHA(丁基羟基茴香醚)、β-胡萝卜素、亚油酸、磺酰罗丹明B(SRB)和紫杉醇(Taxol)均购自Sigma-Aldrich 公司；其他试剂均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3仪器Agilent 气相色谱仪6890，检测器为Agilent 5973 氢火焰离子化检测器(FID)；紫外-可见光分光光度计(UV-2550，Shimadzu，Japan)，酶标仪(Spectra 190，Molecular Device，USA)。

1.4试验方法

1.4.1挥发油提取。将100 g 新鲜紫穗槐果实粉碎，加蒸馏水1 000 mL，水蒸汽蒸馏装置进行蒸馏。收集挥发油和水混合液，离心(5 000 r/min)后用移液器将挥发油取出移至试管中，挥发油得率为4.25%，-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2GC-MS检测条件。色谱柱为DB-17MS毛细管柱，柱长为30 m，内径为0.25 μm，液膜厚度为0.25 μm。采用程序升温，柱温40 ℃保持1 min，以5 ℃/min 速度升温至100 ℃，保持2 min；再以5 ℃/min 升温至220 ℃，保持2 min；最后以60 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min。载气为氦气，流速1 mL/min，进样口温度220 ℃，进样量1 μL，GC和MS接口温度290 ℃。质谱条件为电子轰击能量70 ev，离子源温度230 ℃，扫描质量范围(m/z)40 ～600 amu，采用NIST02 标准谱库进行检索。

1.4.3抗氧化活性。

1.4.3.1DPPH法。参考文献[10]方法，0.2 mL不同浓度的挥发油甲醇溶液加入1.8 mL DPPH甲醇液(25 mg/mL)中，混合液剧烈震荡后在黑暗处放置30 min，然后在517 nm处测定吸光值，计为A样品，以相同体积的甲醇代替样品测定的吸光值为A对照，清除DPPH自由基能力用SC表示，SC=(1-A样/A对照)×100%，其中A对照为不加样品的溶液在t=0时的吸光值，所有吸光值均测定3次，拟合非线性回归曲线，得出IC50值。BHT和BHA为阳性对照。

1.4.3.2β-胡萝卜素-亚油酸法。参考文献[10]方法，20 mg亚油酸和200 mg吐温40混入1 mL的0.5 mg/mL的β-胡萝卜素-氯仿溶液，45 ℃减压浓缩除去氯仿，然后边搅拌边缓慢加入50 mL含氧的蒸馏水，最终形成乳液，0.2 mL的5 mg/mL样品加入5 mL的乳液后立即在470 nm处读取吸光值，用不含有β-胡萝卜素的乳液调零，同时用0.2 mL的甲醇代替样品加入5 mL含β-胡萝卜素的乳液作为阴性对照在470 nm处读取吸光值，然后再将试管放入50 ℃水浴中，每隔15 min测定一次吸光值，直到180 min，通过以下公式计算：抑制率=[1-(A0-At)/(A0′-At′)] ×100%，式中，A0和A0′分别代表样品和对照在0 min时的吸光值，At和At′分别代表样品和对照在180 min时的吸光值。

1.4.4细胞毒活性。采用SRB法进行紫穗槐挥发油对HeLa、A549和BGC-823 3种肿瘤细胞株的细胞毒活性研究，紫杉醇作为阳性对照。肿瘤细胞于37 ℃细胞培养箱中24 h 后，分别加入不同浓度的紫穗槐挥发油，继续培养48 h后，依据文献[11]方法，进行细胞毒活性筛选及分析。

2结果与分析

2.1挥发油的化学成分经GC-MS 分析，从紫穗槐果实挥发油中共分离出50种成分，经标准质谱库检索，鉴定出40个组分(表1)，占挥发油总量的88.65%，主要有γ-杜松烯(19.43%)、α-毕澄茄烯(10.24%)、表圆线藻烯(8.99%)和α-蒎烯(7.22%)等，紫穗槐果实挥发油的大量成分与已有文献研究结果有所不同[8-9]，推测原因为样品采集的时间、地点以及处理方法等不同所致。挥发油的大量成分中杜松烯不仅是常用的香料源，还具有杀菌作用；毕澄茄烯是目前香料工业的重要原料[12]；这些研究结果也为紫穗槐的新应用提供了有益的参考。

表1　紫穗槐果实挥发油成分分析

接下表

2.2紫穗槐果实挥发油的抗氧化活性每一种检测方法都不足以单独评价植物挥发油的抗氧化活性，因此抗氧化活性需要通过多种方法进行综合评价。DPPH自由基清除能力是一种最常见的衡量化合物或提取物抗氧化活性指标，广泛应用于多种抗氧化能力测试[13-14]。试验结果显示，市售强抗氧化剂BHT和BHA的DPPH自由基清除能力很强，IC50值分别为0.48和0.19 mg/mL，而紫穗槐果实挥发油对DPPH自由基清除率的IC50值为18.25 mg/mL。紫穗槐果实挥发油的DPPH自由基清除能力比对照的强抗氧化剂弱约100倍，但也具有一定的抗氧化活性，推测电子转移作用机制不是其抗氧化作用的主要机制。

β-胡萝卜素-亚油酸法主要是评价抗氧化剂在乳化脂质体系中抑制脂质氢过氧化前期的能力[15]。β-胡萝卜素-亚油酸法测定的紫穗槐果实挥发油抗氧化活性(图1)显示，紫穗槐果实挥发油具有较弱的抗氧化活性，其中1.8 mg/mL紫穗槐果实挥发油的抑制率为25.08%，而BHT和BHA的抑制率分别为94.19%和98.47%。与2种强抗氧化剂比较发现，紫穗槐果实挥发油的抑制率与强抗氧化剂之间的差距较DPPH自由基清除试验结果有所缩小，说明紫穗槐果实挥发油可在脂质体系中表现出稍强的抗氧化活性。

图1　紫穗槐果实挥发油在β-胡萝卜素-亚油酸体系中的抑制率Table 1　β-carotene-linoleate inhibition of the volatile oil from Amorpha fruticosa fruits

2.3紫穗槐果实挥发油的细胞毒活性由表2可见，紫穗槐果实挥发油对人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞A-549和人胃癌细胞BGC-823均具有较强的细胞毒活性，其IC50值分别为48.656、46.733和37.597 μg/mL，阳性对照Taxol的IC50值分别为0.375、0.020、0.012 μg/mL，表明紫穗槐果实挥发油对肿瘤细胞具有较强的细胞毒作用。因此，紫穗槐果实挥发油对其他肿瘤细胞的细胞毒活性如何、主要活性成分以及相关作用机制值得进一步深入研究。

表2紫穗槐挥发油的细胞毒活性

Table 2Cytotoxicity activity of the volatile oil fromAmorphafruticosa

μg/mL

3结论

该试验对新鲜紫穗槐果实挥发油的化学成分、抗氧化和细胞毒活性进行了研究，结果表明，新鲜紫穗槐果实挥发油的大量成分主要有γ-杜松烯(19.43%)、α-毕澄茄烯(10.24%)、表圆线藻烯(8.99%)和α-蒎烯(7.22%)等；DPPH法和β-胡萝卜素-亚油酸法测得的挥发油抗氧化能力均较弱；紫穗槐果实挥发油对人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞A-549和人胃癌细胞BGC-823均有较强的细胞毒活性，具有进一步研究的价值。该研究结果为紫穗槐进一步的研究开发与利用提供了有益的参考。

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摘要[目的]研究新鲜紫穗槐果实挥发油的化学成分及其抗氧化和细胞毒活性。[方法]水蒸气蒸馏法提取挥发油后，采用GC-MS法检测其成分组成；采用DPPH和β-胡萝卜素法检测挥发油的抗氧化活性，采用SRB法检测挥发油对BGC-823、A-549和HeLa等3种肿瘤细胞株的细胞毒活性。[结果]从挥发油中共鉴定出40个成分，占挥发油总量的88.65%，主要有γ-杜松烯(19.43%)、α-毕澄茄烯(10.24%)、表圆线藻烯(8.99%)和α-蒎烯(7.22%)等；紫穗槐果实挥发油对DPPH自由基清除率的IC50值为18.25 mg/mL，β-胡萝卜素-亚油酸法检测1.8 mg/mL紫穗槐果实挥发油的抑制率为25.08%；对BGC-823、A-549和HeLa等3种肿瘤细胞的细胞毒IC50值分别为37.597、46.733和48.656 μg/mL。[结论]紫穗槐果实挥发油的抗氧化活性较弱，但具有较好的肿瘤细胞毒活性。

关键词紫穗槐果实；挥发油；化学成分；抗氧化活性；细胞毒活性

Chemical Composition, Antioxidant and Cytotoxic Activity of the Volatile Oil from FreshAmorphafruticosaFruits

CHEN Xiao-qiang1, 2, LI Jia-na3, GUO Yi-ping3, ZHANG Ying1, 2*(1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. State Engineering Laboratory for Bioresource Eco-Utilization, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 3. College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract[Objective] To study the chemical composition, antioxidant and cytotoxic activity of the volatile oil from freshAmorphafruticosafruits. [Method] The volatile oil was isolated by distillation extraction, the chemical compositions were identified by GC-MS method; the antioxidant activity of the volatile oil was assayed by DPPH radical scavenging method and β-carotene-linoleate inhibition method; cytotoxic activity to three tumor cell lines (BGC-823, A-549 and HeLa) was determined by SRB method. [Result] Forty components were identified from the volatile oil, amounted to 88.65% of the oil, γ-cadinene (19.43%), α-cubebene (10.24%), epizonarene (8.99%) and α-pinene (7.22%) were the main components. TheIC50value of DPPH radical scavenging was 18.25 mg/mL; inhibition ratio of the volatile oil (1.8 mg/mL) was 25.08% in β-carotene-linoleate inhibition method. The cytotoxic activity of the volatile oil to BGC-823, A-549 and HeLa cell lines withIC50value of 37.597, 46.733 and 48.656 μg/mL, respectively. [Conclusion] The volatile oil ofAmorphafruticosafruits has less antioxidant activity, however, it has excellent cytotoxic activity to HeLa cell lines.

Key wordsAmorphafruticosafruits; Volatile oil; Chemical composition; Antioxidant activity; Cytotoxic activity

收稿日期2015-12-10

作者简介陈小强(1974- )，男，四川邻水人，副教授，博士，从事天然药物化学成分及活性研究。*通讯作者，副研究员，博士，从事资源植物活性成分研究。

基金项目东北林业大学大学生科研训练项目“不同采收时间对林生茜草提取物活性的影响”；中央高校基本科研业务费专项(2572015CB18，2572015CB17)；黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q15009)；林业公益性行业科研专项(20140470102)。

中图分类号S 567；R 284.1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-159-03