包艳存，李 芳，李书华，李 霞

(山东省潍坊市农业科学院，山东潍坊 261041)



不同组培条件对芦笋试管苗玻璃化的影响

包艳存，李 芳，李书华，李 霞

(山东省潍坊市农业科学院，山东潍坊 261041)

芦笋，学名石刁柏(Asparagusofficinalis)，属百合科天冬门属，是雌雄异株宿根性多年生植物，有“蔬菜之王”和“世界十大名菜之一”之称。其质嫩味鲜，营养价值丰富，风味独特，深受世人的喜爱[1-2]。芦笋雌雄异株，亲本繁殖困难，分株法繁殖速度慢。组织培养能较好地保持良种的优良性状，繁殖系数高，应用于芦笋品种的杂交选育和亲本繁殖过程中，可迅速扩大亲本数量，缩短育种年限，提高制种产量[3]。

多年组培经验表明，在芦笋组织培养中，反复继代培养尤其是继代增殖培养4～6代，会出现严重的玻璃化现象。而玻璃化一旦形成，很难将其恢复成正常植株，严重影响了芦笋的增殖效率。笔者通过对影响组培苗玻璃化的因素进行研究，探讨芦笋继代培养4～6代时由于大量试管苗玻璃化而影响增殖效率的解决途径。

1材料与方法

1.1试验时间、地点于2014年在山东省潍坊市农业科学院生物所组培实验室进行。

1.2试验材料供试材料为芦笋育种材料“中21”，取自潍坊市农业科学院新品种繁育基地。

1.3试验方法将经过3代继代增殖培养的愈伤组织，接种于增殖培养基中。增殖培养基以MS为基本培养基。采用单因子对比试验，每个处理样本为40个，分接在20瓶中，试验重复3次。添加6-BA 0.50 mg/L(涉及6-BA浓度影响除外)、NAA 0.05 mg/L、KT 0.10 mg/L，附加蔗糖40 g/L、琼脂粉6 g/L(涉及蔗糖、琼脂粉浓度影响除外)，pH 调至5.8。培养温度25 ℃(温度处理除外)，光照强度2 500 lx(光照强度处理除外)，光照时间12 h/d。以25 d为一周期，继代培养2次。统计增殖系数和玻璃化率，增殖系数=增殖苗数/接种苗数；玻璃化率=(玻璃化苗数/接种苗数)×100%。

1.3.1不同6-BA浓度的影响。6-BA浓度分别为0.3、0.5、0.8 mg/L及0.3与0.5 mg/L变换、0.5与0.8 mg/L变换，共5个处理。

1.3.2不同培养温度的影响。接种后的培养温度分别为20、25 ℃及20与25 ℃变温处理，共3 个处理。变温处理天数为20 ℃培养15 d，25 ℃培养10 d。

1.3.3不同光照强度的影响。光照强度分别为2 500、3 500、4 200 lx，共3个处理。

1.3.4不同蔗糖浓度的影响。培养基中添加的蔗糖浓度分别为40、50、60 g/L，共3 个处理。

1.3.5不同琼脂浓度的影响。培养基中添加的琼脂浓度分别为6、8、10 g/L，共3 个处理。

2结果与分析

2.1不同6-BA浓度的影响在进行亲本茎尖启动培养时发现，当6-BA浓度为0.8 mg/L时，增殖效果最好。由表1可知，在一次增殖中当6-BA浓度达0.5 mg/L时，增殖系数最大，为1.70；当6-BA浓度为0.8 mg/L时，增殖系数反而下降。其原因是6-BA浓度为0.8 mg/L时玻璃化率达到50%，从而影响了其增殖系数(图1)。这与芦笋继代增殖4～5代时，其玻璃化程度严重相吻合。当6-BA浓度为0.3 mg/L时，一次玻璃化苗数最少，只有3株。随着再次继代培养，在6-BA浓度为0.3与0.5 mg/L的培养基上交换培养，虽然玻璃化苗比0.3 mg/L的多2株，但其增殖系数最大，达到2.950。因此选择采用6-BA 0.3与0.5 mg/L的培养基上交换培养。

图1　正常苗与玻璃化苗Fig. 1　Normal seedlings and vitrified seedlings

6-BA浓度6-BAconcentrationmg/L接种苗数Numberofinoculatedseedlings一次增殖苗数Thefirstproliferatedseedlings一次玻璃化苗数Thefirstvitrifiedseedlings二次增殖苗数Thesecondproliferatedseedlings二次玻璃化苗数Thesecondvitrifiedseedlings一次增殖系数Thefirstmultiplicationcoefficient一次玻璃化率Thefirstvitrificationrate∥%二次增殖系数Thesecondmultiplicationcoefficient0.3406539581.207.52.3750.54068890401.7020.02.2500.3/0.540--11810--2.9500.840502070751.2550.01.7500.5/0.840--8060--1.500

2.2不同培养温度的影响由表2可知，不同培养温度对芦笋玻璃化有显著影响，同时对增殖系数有极显著影响。在一定温度范围内(20～25 ℃)，随着培养温度的升高，芦笋试管苗玻璃化率明显提高，在一次增殖中，25 ℃时增殖苗数最多，为68株。而在二次增殖时，20与25 ℃的变温培养增殖苗数最多，为108株，玻璃化苗数10株，增殖系数为2.70；25 ℃时增殖苗数为90株，玻璃化苗数40株，增殖系数为2.25。综合考虑，选择20/25 ℃的变温培养。

表2　不同培养温度对继代增殖及玻璃化的影响

2.3不同光照强度的影响由表3可知，不同光照强度对玻璃化率有显著影响，随着光照强度的增加，玻璃化率明显降低。二次增殖时，当光照强度为4 200 lx 时，玻璃化苗数只有8株，显著低于2 500 lx 时的40株。增殖系数随着光照强度的增加呈增长趋势，但差异不显著。当光照强度为4 200 lx时，二次增殖系数最大，为2.75。因此选择4 200 lx的光照强度。

表3　不同光照强度对继代增殖及玻璃化的影响

2.4不同蔗糖浓度的影响由表4可知，蔗糖浓度对玻璃化率有显著影响(尤其是二次培养)，随着蔗糖浓度的增加，玻璃化率明显降低。二次增殖时，当蔗糖浓度为60 g/L时，玻璃化苗数为14株，显著低于40 g/L时的40株。增殖系数受蔗糖浓度的影响较小，但随着蔗糖浓度的增加呈增加趋势。考虑到成本问题，选择蔗糖浓度为50 g/L。

表4　不同蔗糖浓度对继代增殖及玻璃化的影响

2.5不同琼脂浓度的影响由表5可知，不同琼脂浓度对增殖系数有一定影响，在一定浓度范围内(6～8 g/L)，随着琼脂浓度升高，增殖系数有所上升。琼脂浓度对玻璃化率(尤其是二次培养)有显著影响。当琼脂浓度为10 g/L 时，二次增殖玻璃化苗数最少，为12株，增殖系数为2.30。当琼脂浓度为8 g/L时，二次增殖系数为2.45。综合考虑成本和增殖系数，选择琼脂浓度为8 g/L。

表5　不同琼脂浓度对继代增殖及玻璃化的影响

3结论与讨论

笔者研究了芦笋继代增殖4～5代时，对其增殖效率和玻璃化率产生影响的因素，从而选择合适的培养条件，顺利度过增殖培养的危险期。结果表明，6-BA浓度、培养温度、光照强度、蔗糖与琼脂浓度5种因素对继代培养4～5代的芦笋试管苗玻璃化都有显著影响，其中以6-BA浓度、培养温度、光照强度的影响最大，蔗糖和琼脂浓度对增殖系数没有显著影响。

该研究发现随着琼脂或蔗糖浓度的增加，玻璃化苗减少，但超过一定浓度也会降低芦笋的增殖系数。当琼脂浓度为8 g/L 时，一次培养增殖所得苗数为72株，二次培养增殖所得苗数为98株。而当琼脂浓度为10 g/L时，一次培养增殖所得苗数为66株，二次培养增殖所得苗数为92株，增殖系数降低。原因可能是提高培养基中琼脂或蔗糖浓度，可降低培养基中的渗透势，阻碍细胞过度吸水，从而降低玻璃化苗的比例[4]。当琼脂浓度过高时，培养基硬化，影响了试管苗对养分的吸收，降低了增殖系数；蔗糖浓度过高时，碳源过剩，不利于分化，增殖系数降低[5]。

该试验中，随着光照强度的增加，玻璃化率降低，增殖系数变大。金波等[6]、肖玉兰等[7]认为，在一定范围内，植物的光合强度与光照强度成正相关，光照强光合作用强，合成更多的有机物，有利于试管苗的正常生长，减少玻璃化现象，这与该试验结果一致。在一定光照强度范围内光照有利于植物生长，当光照强度超过一定范围后，对一些植物将产生负面影响[8]。Lees 等[9]认为过高的光照强度会导致试管苗光合作用能力及量子效率降低。该试验结果表明4 200 lx为芦笋组培适宜的光照强度。

周俊辉等[10]、时群等[11]研究表明，温度的高低与玻璃化的产生具有一定的相关性，培养温度升高，玻璃化率也增加。其原因可能是高温会刺激细胞新陈代谢，细胞快速分裂，愈伤组织疏松，从而导致玻璃化[12]，这与该试验结果一致。但温度对芦笋的增殖系数也存在显著影响，在一定范围内，温度越高增殖系数越大，在芦笋继代增殖4代时，25 ℃时增殖系数最大，但第5代时，由于其大量玻璃化，增殖系数反而降低，表明温度对玻璃化的影响大于其对增殖系数的影响。

Mujib 等[13]认为6-BA 是组培苗玻璃化的根源之一，一定的6-BA 浓度诱导细胞分裂活性增强，加上衬质势高，新分裂的细胞膨胀、伸长，扰乱了正常的生长发育过程，出现不平衡，产生玻璃苗。该试验发现，6-BA 浓度越高，组培苗玻璃化率越高，此现象可能是Mujib等[13]所述原因导致。

综合多种因素考虑，最终选择MS培养基，附加蔗糖50 g/L，琼脂粉8 g/L，pH 5.8，光照强度4 200 lx，光照时间12 h/d，每周期先在20 ℃培养15 d，再在25 ℃培养10 d。NAA 0.05 mg/L，KT 0.1 mg/L，先在6-BA 0.3 mg/L的培养基上培养一代，再在6-BA 0.5 mg/L的培养基上培养的方式度过芦笋增殖培养玻璃化高峰期。

参考文献

[1] 李书华.芦笋标准化栽培技术[M].北京：中国农业出版社，2004：8-14，67-69.

[2] 叶劲松.芦笋的食疗与食谱[M].北京：台海出版社，2005：15-41.

[3] 沈火林，赵娜，韩清霞，等.芦笋离体快速繁殖中嫩茎增殖培养对根分化的影响[J].华北农学报，2006，21(S1)：46.

[4] 李娅莉，张健，潘远智.观赏植物组织培养过程中玻璃化现象与解决措施进展[J].四川农业大学学报，2004，22(3)：278-282.

[5] 王爱勤，何龙飞，裴润梅，等.组培条件对不同品种芦荟试管苗玻璃化的影响[J].中国农学通报，2002，18(5)：46-48.

[6] 金波，东惠茹，杨孝汉.气体环境和光照对香石竹试管苗生长的影响[J].园艺学报，1993，20(4)：389-393.

[7] 肖玉兰，仇明华，周永和.克服香石竹试管苗玻璃化现象的研究[J].云南农业大学学报，1997，12(3)：188-193.

[8] 王政，郭玉珍，何松林.不同光照强度对彩色马蹄莲试管苗生长的影响[J].西北林学院学报，2011，26(3)：84-87.

[9] LEES R P，EVANS E H. NICHOLAS J R. Effects of the light environmenton photosynthesis and growth in vitro[M].Dordrecht (The Netherlands)：Kluwer Academic Publishers，1994：31-46.

[10] 周俊辉，陈志强，余卓玲，等.鸡冠花离体培养中的玻璃化现象及其控制的初步研究[J].江西农业学报，2006，18(4)：88-90.

[11] 时群，韦大器.不同培养条件对光叶楮试管苗玻璃化的影响[J].亚热带植物科学，2007，36(3)：12-14.

[12] 王小敏，李维林，赵志强，等.不同培养条件对薄荷试管苗玻璃化现象的影响[J].植物资源与环境学报，2006，15(3)：51-54.

[13] MUJIB A，PAL A K. Inter var ietal var iatio n in responseto in vitro cloning of car nation[J]. Crop research hisar，1995，10：190-194.

摘要为有效解决芦笋组培快繁继代增殖培养4～6代时，由于玻璃化试管苗的严重出现而影响增殖效率的问题，对6-BA浓度、培养温度、光照强度、蔗糖浓度、琼脂浓度等因素对芦笋组培玻璃化及增殖效果的影响进行研究。结果显示，玻璃化率随着培养温度和6-BA浓度的降低而有所降低，随光照强度、蔗糖浓度和琼脂浓度的增强而减弱。最终选择MS培养基，附加蔗糖50 g/L,琼脂粉8 g/L，光照强度4 200 lx，先6-BA 0.3 mg/L的培养基上培养一代，再在6-BA 0.5 mg/L的培养基上培养，每周期先在20 ℃培养15 d，再在25 ℃培养10 d的方式来度过芦笋增殖培养玻璃化高峰期。

关键词芦笋；增殖培养；玻璃化；增殖系数

Effects of Tissue Culture Conditions on the Vitrification ofAsparagusofficinalisL.

BAO Yan-cun, LI Fang, LI Shu-hua et al(Weifang Academy of Agricultural Sciences, Weifang, Shandong 261041)

AbstractFactors affecting the vitrification and proliferation during the 4-6 generations ofAsparagusofficinalisL. were studied in tissue culture, such as 6-BA concentration, temperature, light intensity, sucrose concentration, agar concentration and other factors. Results showed that vitrification percentage reduced as the culture temperature and 6-BA concentration decreased, and weakened when the light intensity, sucrose concentration and agar concentration enhanced. MS culture medium adding 50 g/L sucrose and 8 g/L agar powder was selected with the light intensity being 4 200 lx. The first generation was cultured on medium with 0.3 mg/L 6-BA, and then transferred to medium with 0.5 mg/L 6-BA. In each cycle,A.officinaliswas firstly cultured at 20 ℃ for 15 days, and then at 25 ℃ for 10 days. By this way,A.officinaliscould go through its vitrification peak.

Key wordsAsparagusofficinalisL.; Proliferation culture; Vitrification; Multiplication coefficient

收稿日期2015-12-07

作者简介包艳存(1979- )，女，湖北随州人，农艺师，农业推广硕士，从事芦笋育种与栽培工作。

基金项目农业部公益性行业专项(农业)科研专项(201003074-1-3)。

中图分类号S 603.6

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-223-03