关立增，娄安钢，朴明淑，蔡锦顺

(延边大学农学院，吉林延吉 133002)



延边黄牛与韩延牛血液Exosome对延边黄牛垂体细胞中GH含量的影响

关立增，娄安钢，朴明淑，蔡锦顺*

(延边大学农学院，吉林延吉 133002)

延边黄牛肉质细腻多汁，鲜美可口，品质优，特别是不饱和脂肪酸、必需氨基酸和风味氨基酸含量明显高于其他品种牛，具有极高的产品发展价值，市场前景广阔[1]。但是，延边黄牛具有生长周期长、饲养成本高和出栏率低等缺点，已严重制约了延边黄牛养殖业的发展[2]。因此，如何提高延边黄牛的生长速度是加快延边黄牛养殖业发展的关键问题之一。韩延牛与延边黄牛的血统相近，而其生长发育速度、初生重及各年龄段体尺和体重均极显著高于延边黄牛[3]，因此研究二者之间在生长方面的差异将为提高延边黄牛的生长速度提供新途径。

Exosome(外胞体)是一类由多种细胞分泌的、直径为30～150 nm并具有膜结构的小囊泡。研究表明，外胞体与动物生长有密切的关系[4]。Melnik等[5]研究发现牛乳中的Exosome可以促进犊牛的生长，垂体细胞中分泌的生长激素(Growth hormone，GH)是直接调控动物生长的重要内分泌激素。因此，关于Exosome通过影响GH分泌来调控动物生长的研究是提高动物生长速度的一个新的途径。笔者选择延边黄牛和韩延牛为研究对象，研究延边黄牛及韩延牛血液外胞体对延边黄牛垂体细胞中GH的调控机制，以期为延边黄牛生长调控提供新资料，也为提高延边黄牛的生长发育速度奠定基础。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器。JEM-1230EX透射电镜(日本)；超高速冷冻离心机(美国Kemdro公司)；SHEL LAB 2406-2型CO2培养箱；ABI MX3000P型荧光定量PCR仪(ABI 美国)；凝胶成像系统(Ultro-Violet Products公司，英国)。

1.1.2试剂。Trizol Reagent(Invitrogen公司)；RNase固相清除剂(北京天泽基因公司)；DMEM/F-12、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、胶原酶 Ⅱ 及青霉素、链霉素，均购自GIBCO公司；M-MLV反转录酶、DNA Marker、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、DNase I、TaqDNA聚合酶，均购自TaKaRa公司；[125I]人生长激素放射免疫分析药盒，购自天津九鼎医学生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1延边黄牛和韩延牛Exosome的提取。分别抽取4～6月龄断乳延边黄牛和韩延牛全血于50 mL离心管中，2 500 r/min离心5 min，取上清获得血浆。将血浆置于超速离心管中，放入超速离心机，50 000 r/min离心60 min；弃上清，用0.01 mol/L PBS将沉淀吹下，使其溶解，再次将其置于超速离心管中，放入超速离心机，50 000 r/min离心60 min；弃上清，加入0.01 mol/L PBS溶液，使用移液器将沉淀反复吹打，使其完全混匀，即为Exosome溶液。然后，在透射电镜下鉴定Exosome形态并拍照。

1.2.2延边黄牛垂体细胞原代培养。在无菌条件下分离延边黄牛垂体组织，分离垂体前叶弃去垂体后叶，在装有500 μL 无Ca2+、Mg2+和PBS溶液的1.5 mL EP中剪碎至1 mm×1 mm组织块，用pH 7.0的PBS冲洗3遍。然后，将组织沉淀转移到培养瓶中，平均每个垂体加入0.5 mL 0.25%胶原酶、0.5 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 ℃水浴摇床孵育消化25 min，最后用含10%胎牛血清的培养基终止消化。用100目细胞筛过滤细胞，将滤液于4 ℃、2 000 r/min离心10 min并弃上清，用DMEM/F12培养液悬浮细胞，放入75 mL培养瓶中于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞从组织块中爬壁生长至80%时，用0.25%的胶原酶消化，并采用差速贴壁法分离细胞，获得原代培养细胞。

1.2.3Exosome对延边黄牛腺垂体细胞GH mRNA表达的影响。 用含10%胎牛血清的DMEM/F12对延边黄牛垂体细胞进行培养，待细胞连接成片后吸弃培养基，用PBS冲洗细胞2次。加入2 mL DMEM/F12培养基预处理细胞4 h，然后用100 μL PBS(对照组)、100 μL延边黄牛血液Exosome(100 ng/mL)和韩延牛血液Exosome(100 ng/mL)对细胞进行处理6 h，每个试验组及对照组均设5个重复。处理结束后收集培养液，用PBS清洗细胞1次，并弃去废液，收集细胞。

采用TRIzol Reagent 提取垂体细胞总RNA，整个过程在冰上操作，总RNA提取后用DNaseI消化以除去痕量DNA的污染。以获得的总RNA为模板，用OligodT-18为引物，在M-MLV逆转录酶催化合成cDNA。使用Primer Premier 5.0软件设计延边黄牛GH基因及β-actin基因的上游引物和下游引物。β-actin的上、下游引物分别为：CCACGAAACTACCTTCAACTC和CCACGAAACTACCTTCAACTC；GH的上、下游引物分别为：CTCCAACTGGCTGCCGACAGCTA和CGATGTCTGCTGGGGCTCGTCC。

在优化反应参数后，进行荧光定量PCR检测，具体反应体系为：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各 0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL。将各成分加入到定量PCR板的各孔中，封膜、振荡混匀，放入qRT-PCR仪中，反应条件为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，40个循环并在延伸结束收集荧光信号；最后95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，绘制溶解曲线并收集荧光信号，每个样品2个重复。GH基因mRNA表达水平采用2-ΔCt法进行计算，其计算公式为ΔCt=GH基因Ct-内参基因Ct。

1.2.4Exosome对延边黄牛腺垂体细胞GH分泌的影响。用含10%胎牛血清的DMEM/F12对延边黄牛垂体细胞进行培养，待细胞连接成片、铺成单层后，吸弃培养基，并用预热的PBS冲洗细胞3次；然后，用DMEM/F12培养基预处理细胞4 h；最后用100 μL PBS(对照组)、100 μL延边黄牛血液Exosome(100 ng/mL)和韩延牛血液Exosome(100 ng/mL)对细胞进行处理，12、24和48 h后收集培养液，使用125I-GH放射免疫检测试剂盒对细胞上清液中GH含量进行检测。

1.2.5数据处理。试验数据使用SPSS 17.0统计软件进行统计与分析，结果均以平均值±标准误表示。对不同处理组间的数值进行单因素方差分析(One-way ANOVA)及邓肯氏多重比较(Duncan’s multiple range test)。P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1延边黄牛和韩延牛Exosome的观察通过对延边黄牛和韩延牛血浆进行一系列离心和超离心后分别获得Exosome。从图1可以看出，延边黄牛和韩延牛血液中含有大量的Exosome，电镜下观察均呈圆形或椭圆形的双层膜小囊泡，直径也均为30～100 nm，膜结构完整。

注：A.延边黄牛血液Exosome；B.韩延牛血液Exosome。Note：A.Blood Exosome from Yanbian yellow cattle；B.Blood Exosome from Hanyan cattle.图1　延边黄牛和韩延牛血液Exosome的透射电镜图(10 000×)Fig.1　Transmission electron microscopes of blood Exosome from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle

2.2Exosome对延边黄牛腺垂体细胞GH mRNA表达的影响从图2、3可以看出，韩延牛Exosome处理的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA表达显著高于延边黄牛Exosome处理组(P>0.05)。这表明韩延牛与延边黄牛Exosome对延边黄牛垂体细胞中GH的mRNA表达有明显影响。

图2　实时定量PCR检测GH mRNA表达的电泳图谱Fig.2　Electrophoretogram of GH mRNA expression by real-time quantitative PCR detection

图3　韩延牛和延边黄牛Exosome对延边黄牛垂体细胞GH 的mRNA表达的影响Fig.3　Effects of Exosome from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on mRNA expression of pituitary cells GH of Yanbian yellow cattle

2.3Exosome对延边黄牛腺垂体细胞GH含量的影响用100 μL延边黄牛血液Exosome(100 ng/mL)和韩延牛血液Exosome(100 ng/mL)对延边黄牛垂体细胞进行处理12、24和48 h后，收集培养液并对细胞上清液中GH含量进行检测。从图4可以看出，韩延牛血液Exosome处理组的垂体中GH含量显著高于延边黄牛血液Exosome处理组。

图4　延边黄牛与韩延牛血液Exosome对延边黄牛垂体细胞中GH含量的影响Fig.4　Effects of blood Exosome of Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on the GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle

3讨论与结论

延边黄牛具有生产高档牛肉的品质特性，而如何提高延边黄牛的生长速度是人们关注的焦点之一。GH是一种具有种属特异性的蛋白激素，可以促进骨、软骨、肌肉及其他组织细胞分裂增殖，促进蛋白质合成，对动物生长发育起着重要的调控作用[6]。关于通过调控GH分泌来影响动物生长的研究是目前的热点之一。研究表明，外胞体(Exosome)对动物的生长有调控作用[7]。笔者研究了延边黄牛及韩延牛血液Exosome对延边黄牛垂体细胞中GH表达的影响，可为提高延边黄牛的生长速度提供一个新的途径。

Exosome是一类由多种细胞分泌的、直径为30～150 nm并具有膜结构的小囊泡，在透射电镜下呈圆形或杯状磷脂双分子层结构[4，8]。该试验中获得的延边黄牛与韩延牛的血液Exosome在电镜观察下均呈圆形或椭圆形的双层膜小囊泡，直径也均为30～100 nm，与以前报道结果相一致。

该试验用100 μL PBS(对照组)、100 μL延边黄牛血液Exosome(100 ng/mL)和韩延牛血液Exosome(100 ng/mL)对延边黄牛垂体细胞进行处理6 h，通过实时荧光定量PCR检测分析延边黄牛垂体细胞中GH的表达。结果表明，韩延牛Exosome处理的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA表达显著高于延边黄牛Exosome处理的垂体细胞。这说明延边黄牛血液Exosome抑制了延边黄牛垂体细胞中GH的mRNA表达。为了进一步研究延边黄牛和韩延牛血液Exosome对延边黄牛垂体细胞中GH表达的影响，分别用延边黄牛和韩延牛血液Exosome对延边黄牛垂体细胞进行处理12、24和48 h后，收集培养液并对细胞上清液中GH含量进行检测。结果表明，韩延牛血液Exosome处理组的垂体中GH的含量显著高于延边黄牛血液Exosome处理组。此结果也进一步证实延边黄牛血液Exosome抑制了延边黄牛垂体细胞中GH的表达，但具体抑制机制有待进一步研究。据推测，这可能与Exosome中含有的miRNAs有关[9]。Qi等[10]研究发现ssc-let-7c可调控猪GH的分泌，同时还预测let-7i、miR-34a、miR-136和miR-326可能与GH的分泌也存在着密切的关系。该研究可为进一步研究Exosome对延边黄牛生长调控的分子机制提供理论基础。

参考文献

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摘要[目的]从延边黄牛和韩延牛血液中分离Exosome(外胞体)，研究2种外胞体对延边黄牛垂体细胞中GH含量的影响。[方法]通过超高速离心等方法，从延边黄牛和韩延牛血液中分离Exosome，并以100 ng/mL的浓度分别转染给原代培养的延边黄牛垂体细胞培养12、24和48 h，对细胞上清液中GH含量进行检测。[结果] 电镜下延边黄牛与韩延牛血液Exosome均呈圆形或椭圆形的双层膜小囊泡，直径均为30～100 nm，膜结构完整。韩延牛Exosome处理组的延边黄牛垂体细胞GH mRNA表达显著高于延边黄牛Exosome处理组(P>0.05)。韩延牛血液Exosome处理组垂体中GH的含量显著高于延边黄牛血液Exosome处理组(P>0.05)。[结论]延边黄牛和韩延牛血液中的Exosome对延边黄牛垂体细胞中GH含量的影响有明显差异。

关键词延边黄牛；韩延牛；血液Exosome；垂体细胞；GH

Effects of Blood Exosome in Yanbian Yellow Cattle and Hanyan Cattle on the GH Content in Pituitary Cells of Yanbian Yellow Cattle

GUAN Li-zeng, LOU An-gang, PIAO Ming-shu, CAI Jin-shun*(College of Agronomy, Yanbian University, Yanji, Jilin 133002)

Abstract[Objective] To study the effects of blood Exosome in Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle on the GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle. [Method] Exosome was isolated from Yanbian yellow cattle and Hanyan cattle by ultra high speed centrifugation method, and then was transfected to primary pituitary cell of Yanbian yellow cattle at a concentration of 100 ng/mL for 12, 24 and 48 h, respectively. Content of GH in cell supernatant was detected by kit. [Result] Electron microscope observation showed Exosomes from Yanbian cattle and Hanyan cattle blood were both a round or oval global double membrane vesicle. Their diameters were both 30-100 nm, and membrane structure was both complete. The expression of GH mRNA in the pituitary cells of Yanbian yellow cattle treated by Hanyan cattle Exosome was significantly higher than that treated by Yanbian yellow cattle Exosome(P>0.05).The content of GH in the pituitary of the Hanyan cattle group treated by blood Exosome was significantly higher than that of the Yanbian yellow cattle(P>0.05). [Conclusion] GH content in pituitary cells of Yanbian yellow cattle treated by blood Exosome of Yanbian yellow cattle shows significant differences with that treated by Hanyan cattle blood Exosome.

Key wordsYanbian yellow cattle; Hanyan cattle; Blood Exosome; Pituitary cells; GH

收稿日期2015-12-14

作者简介关立增(1974- )，男，吉林延吉人，讲师，博士，从事基因表达与调控研究。*通讯作者，副教授，博士，从事动物传染病与预防研究。

中图分类号S 811.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-105-03