史一珺， 宋晓明， 于忠伟， 张洪亮， 焦绪娜， 黄 娟， 单 虎

(1.青岛农业大学 山东省预防兽医学重点实验室， 山东青岛266109；2.乳山市午极镇畜牧兽医工作站，山东乳山264503；3.烟台市饲料监察所， 山东烟台264008)

不同宿主来源犬瘟热病毒H基因的克隆测序与分析

史一珺1， 宋晓明2， 于忠伟3， 张洪亮1， 焦绪娜1， 黄 娟1， 单 虎1

(1.青岛农业大学 山东省预防兽医学重点实验室， 山东青岛266109；2.乳山市午极镇畜牧兽医工作站，山东乳山264503；3.烟台市饲料监察所， 山东烟台264008)

应用RT-PCR的方法从2013-2015年来自我国部分地区20份犬、貂、狐和貉源犬瘟热阳性病料中克隆得到犬瘟热病毒(CDV)H基因。序列分析结果表明，20株CDV的H基因核苷酸与推导氨基酸序列的同源性分别为:90.6%～100%和90.5%～100%；相应地，与CDV3、Onderstepoort等传统疫苗株相比，其同源性分为90.4%～99.9%和89.0%～99.8%。基于CDV H基因推导氨基酸序列构建系统进化树的结果显示，除TS1510属于Amecica-1型外，其余全部为Asia-1型。表明Asia-1型犬瘟热病毒仍为目前一些地区流行基因型，弱毒感染动物也可使之产生典型犬瘟热症状。

犬瘟热病毒； H基因； 同源性比较； 进化树分析

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(CaninedistemperVirus，CDV)引起的一种发病急、传播速度快，可导致犬、狐、貉和貂等多种食肉目动物发病，且接触性极高的传染病[1-2]。CDV易与其他细菌、病毒以混合感染或继发感染的方式危害动物，致死率最高可达80%。CDV对不同宿主动物的跨种属感染，是2016年来许多研究者关注的重点[3-5]。

CDV基因组主要编码N、P、F、M、H、L六个蛋白，其中H基因表达的血凝素蛋白会影响病毒与SLAM受体的识别与结合，且H蛋白的基因、抗原变化频率最高，被认为是导致CDV不断变异的重要因素，常用来评估CDV的变异情况[6-8]。本试验以实验室收集的出现典型犬瘟热症状的患病动物病料为模板，对得到的H基因进行分析，来探究一些地区近年来CDV毒株之间H基因遗传特征差异及病毒在宿主中进化的规律。

1 材料与方法

1.1 病料 临床样品取自山东、河北一些地区毛皮动物养殖场及动物医院送检的临床症状明显的犬瘟热阳性病例。

1.2 试剂 RNA提取试剂盒，购自Bioflux公司；PrimeScriptTMcDNA Synthesis Kit、ExTaqDNA聚合酶、 pMD18-T载体、DH5α细胞、限制性内切酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收、质粒提取试剂盒，均购自Omega公司；其余试剂为国产分析纯。1.3 病毒RNA的提取、反转录及H基因的克隆 用RNA提取试剂盒提取犬瘟热阳性病料中的病毒RNA，用特异性引物(序列：CDV-H-F 5’-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3’，CDV-H-R 5’-AATGCTAGAGATGGTTTAATT-3’)反转录合成病毒cDNA。反转录体系：RNA 10.5 μL，5xRT Buffer 4 μL，dNTP(10mmol/L)2 μL，CDV-H-F (10 pmol/μL)1 μL，CDV-H-R(10 pmol/μL)1 μL，M-MLV(10 U/μL)1 μL， RRI(40 U/μL)0.5 μL，42 ℃水浴1 h后70 ℃ 15 min。以cDNA作为模板参照文献[3]中方法进行PCR扩增。用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物后克隆至pMD18-T载体。各样品选取最少3个酶切鉴定正确的阳性克隆，送至北京华大基因科技服务有限公司测序，结果与GenBank上已公开的CDV H基因序列的ORF进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 H基因的克隆与酶切鉴定 将得到的H基因的PCR产物进行切胶回收，并克隆至pMD18-T 载体，用BamHⅠ和HindⅢ对阳性质粒pMD18-T-H进行双酶切。结果如图1，得到的两条带(分别2 690 bp和1 921 bp左右)与预期值相符。测序结果表明，各样品H基因被成功克隆至pMD18-T载体中。

图1 重组质粒pMD18-T-H酶切鉴定结果

M：DL-5 000； 1-2：pMD18-T-H双酶切后； 3：质粒对照

2.2 H基因同源性分析 序列分析显示，20个CDV H基因的ORF均为1 824 bp，其核苷酸与推导氨基酸序列的同源性分别为90.6%～100%(CY1505与LS1507、WD1303与WD1304、LL1308与ZC1302 CDV H基因的核苷酸序列完全相同)和90.5%～100%，相应地，与CDV3、Onderstepoort等传统疫苗株相比，它们的同源性为90.4%～99.9%和89.0%～99.8%。其中TS1510与America-1型毒株核苷酸和推导氨基酸序列同源性较高，分别为97.0%～99.9%和95.1%～99.8%。

2.3 H基因推导的氨基酸的序列分析 将测得的20个CDV H基因推导的氨基酸序列与国内部分流行株、疫苗株进行比对，结果显示，其中LL1309、RC1508、WD1309、ZC1306、WD1508 H基因推导氨基酸均存在10处潜在N-糖基化位点，分别位在第19，149，309，391，422，456，542，584，587位和603位，与SD(13)7相同。TS1510毒株有7个潜在N-糖基化位点，与CDV3株相同，是首次发现H基因有7个潜在N-糖基化位点的貉源CDV。

2.4 CDV H基因的遗传进化分析 将测得的20个H基因序列和国内外CDV毒株核苷酸序列构建系统进化树，如图2，其中19个在同一个分支上，属于Asia-1型且亲缘关系较近；而TS1510属于America-1型，与其他19株遗传关系较远。

图2 基于CDV H基因核苷酸序列构建的系统进化发生树

(▲：本文所测得的CDV H基因)

3 讨论

如图2可见，CDV可分为Asia-1、Asia-2、Asia-3、Asia-4[8]、America-2、Europe-1、Europe-2、Arctic和America-1(Vaccine)9个基因型[10]。CDV基因型的差异与病毒的分布直接相关，且其毒力会随糖基化位点数的减少而减弱[11]。本文测得来自山东19份病料中的CDV H基因序列均为Asia-1型，可判断为野毒感染动物而发生严重犬瘟热；来自河北的TS1510为America-1型，是首次发现的弱毒感染致貉子发病的犬瘟热病例。CDV与SLAM受体结合的重要区域包含H蛋白第542～544位的氨基酸[12]，它的突变会影响病毒入侵细胞、致病性与抗原蛋白表达水平；本文所测得序列中有5份样品的H基因序列存在10个潜在N-糖基化位点，增加的位点正处于第542～544位，这或许导致CDV H蛋白的中和表位改变，使病毒对疫苗株诱导的中和抗体的中和作用产生逃避，从而使疫苗免疫失败。

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Genetic analysis of haemagglutinin gene of canine distemper virus from Different hosts

SHI Yi-jun1, SONG Xiao-ming2, YU Zhong-wei3, ZHANG Hong-liang1, JIAO Xu-na1, HUANG Juan1, SHAN Hu1

(1.Shandong Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109,China; 2.Animal Husbandry and Veterinary Station of WUJi town,Rushan 264503, China; 3.Inspectorate of feed,Yantai 264008,China)

Twenty field CDV strains were collected from infected dog, mink, fox, and raccoon dog in different places of China in 2013～2015. The H genes were cloned and sequenced. Sequence analysis showed that the similarity of the measured CDV H gene nucleotides and deduced amino acid sequences were as follows: 90.6% to 100% and 90.5% to 100%, corresponding with CDV3. When compared with onderstepoort strains , the similarity for nucleotides and deduced amino acid sequence was 90.4% to 99.9% and 89.0% to 99.8%. Phylogenetic analysis showed that these strains belonged to Asia-1 genotype except TS1510, which belonged to Amecica-1 type. Our findings indicates that Asia-1 type CDV is still the prevalent genotype in some place.

canine distemper virus; H gene; homology; phylogenetic analysis

s:SHAN Hu; HUANG Juan

2016-01-18

史一珺(1989-)，女，硕士，从事动物传染病防治及生物制品学的研究，E-mail：xifan_1989@sina.com

单虎，E-mail：shanhu67@163.com；黄娟，E-mail：happyhj888@163.com

S852.65+9.5

A

0529-6005(2016)12-0031-03