程永静，张春媚，陈颖娟，王芳，高明，黄慈波

(北京医院风湿免疫科，北京 100730)



·论著·

类风湿关节炎患者血清α-微管蛋白的检测及与临床实验室指标的相关性分析

程永静，张春媚，陈颖娟，王芳，高明，黄慈波

(北京医院风湿免疫科，北京 100730)

[摘要]目的利用酶联免疫吸附方法(ELISA)测定类风湿关节炎(RA)患者血清中的α-微管蛋白(α-tubulin)的水平，评价与临床实验室指标的关系，为寻找RA新的血清学标记物，探讨疾病的发病机制提供依据。方法选取RA患者68例，骨关节炎(OA)患者32例，健康对照(HC)32例，各取血清10 μL，应用ELISA方法检测不同患者及健康对照血清α-tubulin水平，应用非配对资料的t检验分析不同患者与健康对照者之间α-tubulin水平的差异,相关性检验分析α-tubulin水平与RA患者年龄、病程、压痛关节数、肿胀关节数、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)水平、DAS28评分、类风湿因子(RF)水平、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)水平的相关性。结果RA患者血清α-tubulin的水平明显高于骨关节炎患者及健康对照(P<0.05)，进一步分析提示α-tubulin水平与RA患者病程长短呈正相关(r=0.307,P=0.023)，与血清类风湿因子水平及IgA水平呈正相关(r=0.558,P=0.0001; r=0.395,P=0.004)。结论 α-tubulin是RA新的血清学标记物，在RA患者的免疫反应中具有一定的意义，可能参与了RA的发病。

[关键词]关节炎,类风湿;微管蛋白; 自身免疫;免疫球蛋白类

类风湿关节炎(RA)是一种慢性全身性自身免疫病，在我国的患病率约为0.2%～0.93%[1]，是一种严重的致残性疾病,严重影响着患者的生存质量和身心健康。近年来，抗环瓜氨酸肽抗体的发现及TNF-α拮抗剂的应用提高了RA的诊断率，改善了患者的生存质量及预后[2-3]。但由于发病机制不明确，仍有很多早期、不典型病例未能得到及时诊断及治疗。基于现状，迫切要求找到与疾病相关的、新的生物标记物。目的是更深入的了解RA的病理过程，寻找可能的途径阻断疾病的病理过程，寻找RA诊断及治疗的新的作用靶点。

α微管蛋白(α-tubulin)是细胞骨架蛋白微管蛋白的亚单位之一，国外学者通过质谱技术研究发现α-tubulin在RA的血清有升高的趋势，但缺乏进一步与临床资料关系及发病机制的探讨[4]。本研究拟用酶联免疫吸附方法，测定RA患者血清中α-tubulin的水平，明确α-tubulin与RA各临床实验室指标之间的关系；为RA的早期诊断寻找新的生物学靶点，为评估病情、探讨疾病发病机制提供新的实验依据。

1对象与方法

1.1研究对象68例RA患者均为2010—2014年期间在北京医院风湿免疫科住院患者，符合2010年美国风湿病学会(ACR)制定的RA 分类标准[5]。其中，女56例，男12例；年龄18～75岁，平均(56.8±10.7)岁；病程1～10年，平均(1.5±2.3)年。选取年龄、性别相匹配的32例骨关节炎(OA)患者，32例健康志愿者作为健康对照组。

1.2研究方法

1.2.1标本采集每例取血2 mL，3000 r/min,离心15 min,取上清,保存于-80 ℃。

1.2.2ELISA方法检测血清中的α-tubulin水平α-tubulin的检测采用α-tubulin ELISA检测试剂盒(Novateinbio公司)。将ELISA检测板常温放置20 min，不同浓度的标准品50 μL加入标准孔，将5倍稀释的血清样本50 μL加入样本孔，同时加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗α-tubulin抗体100 μL，37 ℃孵育1 h。清洗96孔板，加入50 μL底物A(0.02% H2O2)、底物B(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB)，37 ℃避光孵育15 min。加入1M硫酸终止液50 μL。在450 nm波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线，按照曲线方程计算样本的浓度。

1.3统计学处理应用SPSS16.0统计软件，对RA、OA与健康对照之间血清α-tubulin水平的差异采用独立样本资料的t检验。对α-tubulin与RA疼痛关节数，肿胀关节数等非连续性变量之间的相关性分析采用Spearman相关性分析，对α-tubulin与年龄、病程、ESR、CRP、DAS28评分、RF水平 、IgG、IgA、IgM等联系性变量之间的相关性分析采用Pearson相关性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RA患者与健康对照者血清中的α-tubulin水平比较RA患者血清中α-tubulin水平[(37.90±37.09) μg/L]明显高于健康对照[(14.52±10.99) μg/L]，两者之间差异有统计学意义(t=4.824,P<0.01); 骨关节炎(OA)患者血清中的α-tubulin水平[(15.59±15.64) μg/L]与健康对照[(14.52±10.99) μg/L]差异无统计学意义 (t=0.334,P=0.739)。

2.2α-tubulin水平与RA临床及实验室相关性分析将RA患者血清α-tubulin水平与患者年龄、病程、压痛关节数、肿胀关节数、红细胞沉降率、C反应蛋白水平、DAS28评分、类风湿因子水平、免疫球蛋白水平等临床及实验室指标做相关性分析，发现α-tubulin水平与RA患者RF及IgA水平呈正相关(r=0.558,P=0.0001;r=0.395,P=0.004，如图1所示)，与病程长短呈正相关(r=0.307,P=0.023)。

3讨论

微管蛋白是细胞的一种骨架蛋白，对维持细胞形态、细胞内物质运输和胞器定位等细胞功能起关键作用。α-tubulin和β-tubulin两种蛋白亚单位与微管辅助蛋白(MAPs) 一同构成微管,两者交替以螺旋状形式形成二聚体,并首尾相连构成原纤维,对细胞有明显的支持作用,被认为是细胞的主要“骨骼”。通常情况下,α-tubulin和β-tubulin的表达水平不会发生改变，因此常被用于蛋白差异表达研究的内参。

目前对微管蛋白的研究多集中在肿瘤方面。研究发现微管蛋白的表达可能与肿瘤发生和细胞增殖失控,以及肿瘤细胞的恶性生物学行为相关[6]。当肿瘤细胞增殖活跃时，有丝分裂处于活跃状态，相应的微管蛋白异常表达。因此，研究者将微管蛋白作为肿瘤细胞增殖的血清学标记物之一[7]。同时，微管稳定剂(MSAs)，一种靶点在微管蛋白的抗肿瘤药物，在肿瘤治疗领域显示出了良好的应用前景[8]。

近年来逐渐发现tubulin在自身免疫病患者有增高的趋势。Zheng等[4]通过反相高效液相色谱(HPLC)及线性离子阱质谱分析(linear ion trap-FT-MS)方法研究发现RA患者血清中tubulin的水平增高。Kamada通过二维胶和质谱分析技术研究发现RA患者骨髓源性粘连细胞(BMACs)的α-tubulin的表达水平明显高于OA患者[9]。目前缺乏进一步与临床资料关系的研究及发病机制的探讨。

本研究发现，RA患者血清中α-tubulin水平明显高于健康对照，且α-tubulin水平与类风湿因子水平、IgA水平呈显著正相关(P<0.05)，研究结果提示α-tubulin参与了RA的发病，但并不提示是一种急性相蛋白，更多的与RA患者免疫反应相关。

关于tubulin在自身免疫病发病机制的作用。已知微管蛋白主要参与了血管内皮细胞的生成、迁移[10]，而血管炎是类风湿关节炎等自身免疫性疾病的病理基础之一。研究者推测，血管炎可使血管内皮细胞破坏，微管解聚，α-tubulin释放入血，可能是构成自身免疫病患者血清α-tubulin水平升高的病理机制之一。

同时，有学者提出α-tubulin作为一种自身抗原参与了自身免疫病的发病。研究发现，肺移植后出现慢性排斥反应患者K-α1 tubulin抗体的水平明显高于不出现的患者及健康对照者。且抗K-α1 tubulin抗体的浓度越高，发生慢性排斥反应的危险性越高。研究者推测抗体与气道表皮细胞K-α1 tubulin结合激活转录因子 TCF5和c-Myc,引起纤维源性生长因子的表达增高,最终激活细胞周期及纤维增殖信号系统，诱发肺移植后的免疫病理反应[11-12]。本研究中，RA患者血清中α-tubulin水平与类风湿因子水平、IgA水平呈显著正相关(P<0.05)，进一步提示了α-tubulin参与了体内的免疫炎性反应。

(本文图1见封三)

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金(31140008)；首都医学发展基金项目(首发-1-4051); 北京医院院内基金项目(BJ-2014-033)

作者简介：程永静，博士，主任医师，Email:mastercheng99@hotmail.com

中图分类号:R593.22

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.03.001

(收稿日期：2016-01-04)

The detection and correlation research of α-tubulin and disease activity parameters in rheumatoid arthritis

ChengYongjing,ZhangChunmei,ChenYingjuan,WangFang,GaoMing,HuangCibo

(DepartmentofRheumatologyandImmunology,BeijingHospital,Beijing100730 ,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect serum α-tubulin in patients with rheumatoid arthritis (RA) and analyze the correlation between serum α-tubulin and clinical, laboratory parameters of RA, provided the theoretical basis to seek the pathogenesis of diseases.MethodsBlood samples from 68 patients with RA,32 patients with Osteoarthritis(OA) and 32 healthy controls were collected. Serum α-tubulin were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Difference of α-tubulin between RA patients,OA patients and healthy controls was analyzed by independent sample t test. Correlation analysis was done between α-tubulin level and clinical, laboratory parameters of RA,including age, disease duration, number of tender joints, number of swelling joints, DAS28 score and levels of ESR, C-reactive protein (CRP), Rheumatoid Factor (RF), immunoglobin G (IgG), immunoglobin A (IgA) and immunoglobin M (IgM). ResultsThe α-tubulin of RAwas obviously higher than that of OA patients and healthy controls (P<0.01). Further analysis demonstrated that α-tubulin level was positively correlated with the disease duration(r=0.307,P=0.023), levels of RF and IgA(r=0.558,P=0.0001; r=0.395,P=0.004). Conclusionα-tubulin may play roles in the development o f RA and may be a potential biomarker of of RA.

[Key words]Arthritis,rheumatoid; Tubulin;Autoimmunity; Immunoglobulins