李昆朋

（山东省青州市畜牧局，山东青州 262500）

传染性支气管炎病毒活疫苗毒株在禽流感病毒H9N2毒株感染过程中的协同作用

李昆朋

（山东省青州市畜牧局，山东青州 262500）

H9N2亚型禽流感病毒已成为威胁我国商品鸡健康的重要因素，本研究调查研究了H9N2禽流感病毒和传染性支气管炎病毒疫苗株H120的混合感染，混合感染组的发病率60%和死亡率6%，显著高于H9N2的单独感染组3%和0%，而且混合感染组的排毒时间高于单独感染组，提示传染性支气管炎病毒能够增强H9N2禽流感病毒在体内的增值。本研究旨在探索IBV活疫苗是否对H9N2毒株感染起到协同作用。

H9N2亚型禽流感病毒 传染性支气管炎疫苗 试验方法 结果

1 材料

1.1 病毒

禽流感病毒（AIV）A /CK/SD/qd/ 2012（H9N2）和商用传染性支气管炎疫苗。

1.2 实验动物

9日龄SPF鸡胚、1日龄SPF白来航鸡。

1.3 所用试剂

1.3.1 生理盐水：4.5g NaCl溶于400ml水中，定容至500ml，室温保存。

1.3.2 PBS（0.01M），pH 7.3

1.3.3 含三抗的PBS（10，000IU/ml）

1.3.4 Alsever液

1.3.5 1 %鸡红血球：健康鸡翅下静脉采血，用Alsever液作为抗凝剂，然后加入灭菌的生理盐水洗涤，2，000rpm离心10min，除去上清及中间白细胞层，重复以上操作2次。最后2，500rpm离心15min，量取红细胞泥，用生理盐水做100倍稀释，配制成1%的鸡红细胞悬液，4℃保存。

2 方法

通过红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）结果以++++、+++、++、+和-表示。结果判定以++为终点。依此标准判定：以能够抑制病毒凝集红细胞的最大血清稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。判定HI效价大于或等于8的血清样本为H9亚型流感病毒抗体阳性（Palmer D. F. et al.，1975）。

2.1 病毒的繁殖及EID50的测定

2.1.1 病毒的繁殖

取含病毒尿囊液接种10日龄SPF鸡胚（0.2ml/枚），35℃下孵育48h，弃去24h内死胚，将24～48h内死亡和存活鸡胚置4℃冰箱过夜或-20℃冷冻40min，无菌收获尿囊液，测定其血凝效价，将有效价的新鲜尿囊液分装，保存于-80℃备用。

2.1.2 EID50的测定

按常规方法测定鸡胚半数感染量（EID50），进行病毒滴定。取病毒悬液作10倍倍比稀释，从10-1稀释到10-10，稀释液为PBS，从10-4～10-10每个稀释度接种5枚鸡胚（0.1ml/枚），35℃孵育48h，将鸡胚于4℃过夜，收获尿囊液，测定其血凝效价，按Reed-Muech法计算半数感染量：

EID50=高于50%感染率的病毒稀释度对数+相应距离比×稀释系数的对数（10倍递进稀释为1）

2.2 鸡的致病性试验

2.2.1 动物分组

120只1日龄SPF雏鸡随机分为A、B、C、D四组，每组单独饲养与四个隔离器中，给予相同的饲养条件。

2.2.2 攻毒途径与剂量

21日龄时，A组雏鸡通过滴鼻接种106EID50 H9N2 AIV；B组通过滴鼻接种一个剂量的IBV疫苗；C组通过滴鼻接种106EID50 H9N2 AIV和一个剂量的IBV；D组接种磷酸盐缓冲盐水（PBS）为阴性对照组。实验中不接种其他疫苗，每天监测鸡的一般状况，临床症状，排毒情况和死亡率。

2.2.3 病变观察鸡病毒的分离与测定

在整个实验中，观察实验组鸡只临床变化。分别于攻毒后第3、5、7、9、11d采集各组攻毒组鸡只的咽拭子、泄殖腔拭子进行病毒分离。在攻毒后第3、5、7d剖杀各组攻毒组鸡只5只，采集肺、肾、脾、肝、脑、十二指肠，每个组织取部分用10%福尔马林生理盐水固定液进行固定备用，剩余的组织进行病毒分离和滴定。各组织称量后，按照1：4（W/V）的比例加入含双抗的冷PBS，采集咽拭子和泄殖腔拭子所用PBS的抗生素浓度为10，000IU/ml，其病毒分离和滴定程序同上。

3 结果

3.1 临床症状

接种病毒前，对所有群体的日常监测结果表明，所有的鸡临床正常，没有发现任何的异常。A组单独接种H9N2 AIV组出现轻微一过性临床症状，有两只鸡稍微有点乍毛。B组单独接种IBV H120疫苗组，无明显的临床症状。C组H9N2 AIV+ IBV H120组在攻毒后出现明显的精神抑郁、张口喘、羽毛乱等临床症状，并有鸡死亡。D组生理盐水对照组无任何临床症状。

3.2 发病率统计

每天对四组SPF鸡分别观察至攻毒后第15d，观察并记录各组发病鸡的数量和发病严重程度，计算发病率主要表现为呼吸道症状，同时精神萎靡，乏力蹲坐。

3.3 剖检变化

死亡鸡的呼吸系统尸检发现死后检查显示气管充血，肺充血、渗出，在气管分叉管型形成，延伸到下支气管。

禽流感病毒+ IBLV接种组死鸡中形成气管分叉管型（箭）延伸到支气管。

3.4 排毒时间统计

H9N2 AIV单独感染组喉头的排毒高峰期在感染后3～5d；泄殖腔仅在攻毒后3d检测到病毒。而混合感染组无论是喉头还是泄殖腔的排毒水平和排毒时间均高于单独感染组。两组喉头的排毒水平均高于泄殖腔。与H9N2 AIV单独感染相比，混合感染对H9N2 AIV喉头的排毒周期无明显影响；但明显延长了泄殖腔的排毒周期。

4 讨论

从以上实验结果分析，H120显著增强了H9N2 AIV在各器官的定植和繁殖能力。H9N2 AIV和其他病原微生物之间存在协同致病的作用；H120疫苗株和H9N2 AIV 是导致支气管干酪样栓子的形成的重要病因。已有研究表明，冠状病毒IBV能够编码类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶功能区，这种类胰蛋白酶的存在可能会增强H9N2 AIV的致病性。混合感染的情况下，IBV可能刺激机体产生相应的蛋白裂解酶，从而增强了H9N2 AIV的致病性。

［1］陈伯伦，张泽纪，和陈伟斌.禽流感研究：鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定［J］.中国兽医杂志，1994，20（10）：3-5.