韩悦河南师范大学生命科学学院

单细胞测序技术的研究与应用进展

韩悦
河南师范大学生命科学学院

传统的测序方法是对细胞群体的总平均反应进行分析，而细胞间存在异质性。单细胞测序是在单个细胞水平上进行的高通量测序技术，可准确测出单个细胞的基因结构及表达状态，分析同一表型细胞间的遗传异质性，在癌症、微生物学等领域有举足轻重的地位。本文对单细胞测序主要流程及该技术在不同领域的应用进展进行阐述，为这一技术的研究与发展提供参考。

单细胞分离；基因组扩增；应用

随着科技水平的发展，DNA测序技术经历了巨大的革命。从20世纪70年代中期以Sanger为代表发明的第一代测序技术--双脱氧链终止法，到2005年后涌现出以454、Solexa、SOLiD为第二代标志的高通量测序技术，再到第三代的单分子测序技术，DNA测序技术在成本、读长和通量三方面都发生很大的变化。其中应用最广泛的当属高通量测序技术，但这种测序手段也存在一些问题：传统的测序方法是对细胞群体的总平均反应进行分析，而细胞间存在异质性，由此单细胞测序技术应运而生。

单细胞测序是在单个细胞水平上进行的高通量测序技术，可准确测出单个细胞的基因结构及表达状态，分析同一表型细胞间的遗传异质性，在癌症、微生物学等领域有举足轻重的地位[1]。单细胞检测技术操作步骤主要包括四步：单个细胞的分离、细胞溶解与基因组的提取、基因组或转录组扩增，基因组测序。其中单细胞的分离与基因组或转录组的扩增技术还有待提高，这对单细胞测序的发展既是机遇也是挑战。本文对单细胞测序主要流程及该技术在不同领域的应用进展进行阐述，为这一技术的研究与发展提供参考。

1.单细胞的分离

获取分离的单个细胞是进行单细胞测序研究的第一步，也是单细胞测序与传统高通量测序技术的最大区别。目前可采用的分离方法有有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选法（FACS）、和微流控技术等。

有限稀释法是将获取的细胞系按比例稀释配制成不同浓度的细胞悬液，然后将其接种于多孔培养板上培养，以获得单个细胞。该方法操作简便，成本低，适用于研究可培养的样本；但操作费时，不能进行大规模的细胞分离，分离过程常出现细胞丢失或分离错误等现象。显微操作法需要在倒置显微镜下借助机械显微操作仪进行精细操作，优点在于成本低廉，分离过程可视化且容易操作；缺点在于细胞机械性损伤，适于低通量的细胞操作。

荧光激活细胞分选法是当前应用最广泛的细胞分离方法。该方法通量高，灵敏度高，但需制备大量样品。随着技术的发展，又兴起了一种名为微流控装置的新技术。是通过人工调控流体流动将样品流经微通道，该通道直径可在数十到数百微米范围调节，当设置大小仅可通过一个细胞[2]，以这种方式达到细胞分离的目的。优点在于该方法通量高，操作灵活，样品需求量小，极大程度上避免了样品的污染；但价格昂贵。

2.单细胞基因组或转录组的扩增

高通量测序所需样品量至少为数十纳克，而单细胞中仅含有数匹克的DNA或mRNA，因此对基因组或转录组进行了扩增是必要的。

2.1细胞溶解与基因组的获取

获得的单个细胞需要将其细胞膜溶解以获取基因组DNA （gDNA)或mRNA。一般常采用的细胞溶解方法包括物理法、化学法和酶解法，方法的选择要根据细胞特性、gDNA或mRNA纯化的难易程度等方面综合考虑，有时需使用多种方法结合以达到理想效果。为了防止gDNA在纯化时发生基因丢失现象，故常忽略此操作，因此要对细胞溶解这一步骤进行严格操作。此外，还要避免采用的溶解试剂与gDNA或mRNA扩增试剂相互作用而影响扩增效果。

2.2单细胞基因组的扩增

2.2.1单细胞全基因组扩增

全基因组扩增（WGA）是将从单细胞中提取出的DNA进行扩增以获取大量DNA样品的技术。Roger Lasken团队通过研发多重置换扩增技术，成为世界上首个成功对单细胞DNA扩增及测序的团队。这项技术利用Phi29等聚合酶可以将通过变性、退火、结合到模板DNA上的任意随机引物进行不断延伸。在聚合酶的作用下，将在其附近的延伸链置换下来，且每一种聚合酶都能完成邻近延伸链的置换，从而获得可覆盖全基因组的大量小片段及大片段产物用来进行基因测序。

为克服基因组的扩增偏倚现象，谢晓亮教授等在2012年研发一种新技术--多重退火环状扩增循环技术[3]，该技术将MDA与PCR的优点相结合，同时利用环状DNA分子不能扩增这一原理，将基因组先采用MDA进行5轮预扩增，新扩增出的大量产物可闭合的形成环状分子，使扩增过程变为线性扩增。然后进行PCR扩增，最终获得扩增较均一的单细胞全基因组。

2.2.2单细胞转录组的扩增

转录组的扩增需要将单细胞内的mRNA提取后，通过反转录成cDNA，然后对cDNA进行扩增。一般常采用PCR指数扩增、体外转录线性扩增和Phi29聚合酶扩增三种方法。PCR扩增法是通过在cDNA两端加上锚定引物后进行PCR扩增[4]。反转录过程中通常在转录本（成熟mRNA）的3’端引入引物oligo(dT)，5’端可采用STRT-seq和Smart-seq方法引入锚定引物。体外转录扩增法中，反转录是用T7 RNA聚合酶启动子序列和oligo(dT)分别作为5’和3’端的引物合成第一链cDNA,并随后合成第二链，然后T7 RNA聚合酶以第二链cDNA为的模板在体外进行转录。

3.单细胞测序技术的应用

3.1肿瘤研究

3.1.1乳腺癌的演变

通过制备两个肿瘤样品，一种是有不同类型的肿瘤细胞组成的多基因组型，另一种是单一遗传型细胞组成的单基因组型，然后利用流式分选仪分离出一百个上述的两种细胞类型并进行全基因组测序。研究结果表明，第一种多基因组型肿瘤细胞有三种克隆表达，而第二种单基因组肿瘤细胞是由单个肿瘤细胞以单克隆形式组成，这揭示肿瘤细胞的演变是间断性而非逐步发生的。这一研究结果为癌症的研究与临床治疗提供了重要依据。

3.1.2基因诊断与癌症无创治疗[5]

通过对单个肿瘤细胞的全基因组进行测序，并与人类正常基因图谱进行比对，可找出引起癌症的突变基因。利用这种方法进行基因检测，可以检查出潜在的癌基因，了解肿瘤的起源和生长规律，以便进行及时预防、治疗。

大多数癌症患者由于肿瘤细胞的转移而治疗无效死亡，这一过程往往是肿瘤细胞通过外周血循环来实现转移。对外周血循环肿瘤细胞进行全基因组测序与外显子测序，可以了解肿瘤细胞转移过程的机制，使癌症的无创治疗成为可能，同时对癌症的治疗、预后以及复发均有很好的指导作用。

3.2微生物研究

单细胞测序技术为研究自然界难以培养的微生物提供可能。通过对单个微生物进行全基因组测序，可以逐步构建更加完备的微生物基因库，利于对存在于海洋等蕴含丰富资源的环境中微生物种类及功能的检定，促进科学家对微生物进化、生长等生命活动的研究。

4.前景展望

单细胞测序技术对研究细胞异质性问题上提供了极大的帮助，在肿瘤的研究与临床治疗、微生物学研究等领域已取得一定成果。但在技术操作上还存在一些问题，如单细胞分离对细胞的损伤，细胞溶解过程中遗传物质的丢失，扩增过程中出现的基因偏倚性等问题。因此，技术方法的革新可推动单细胞测序的发展与应用。此外，应注意单细胞基因的表达受所处环境的影响，对单细胞转录组进行测序时，应注意单细胞的情况不一定能揭示细胞群体的基因表达规律。此外，单细胞基因的表达受所处环境的影响，对单细胞转录组进行测序时，应注意单细胞的情况不一定能揭示细胞群体的基因表达规律。

总的来说，单细胞测序技术具有广阔的前景，尤其是在探究癌症的发生、转移机制、耐药性机制以及预后检测等方面。相信随着单细胞分离及基因组扩增技术的发展，对肿瘤细胞的生长规律、耐药机制研究的不断深入，癌症无创治疗将会成为现实。

[1]朱忠旭，陈新.单细胞测序技术及应用进展[J].基因组学与应用生物学，2015,34（5）：902-908.

[2]Yin H,Marshall D.Microfluidics for single cell analysis[J].Cur⁃rent Opinion in Biotechnology,2012,23(1):110-119.

[3]Zong C,Lu S.and Xie X.S.,2012,Genome-wide detection of sin⁃gle-nucleotide and copy-number variations of a single human cell,Sci⁃ence 338(6114):1622-1626.

[4]文路，汤富酬.单细胞测序分析研究进展[J].生命科学，2014,26(3）：228-233.

[5]Ni X，et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(52):21083-21088.

韩悦（1995-），女，汉族，河南新乡人，河南师范大学生命科学学院2013级生物技术专业在读本科生。