张春红，杨帆，杜锡贤，范玉，张欢欢，张春敏，韩长玉

(1山东大学第二医院，济南 250033；2山东中医药大学附属医院)



落新妇苷对永生化人角质形成细胞HaCaT增殖、凋亡的影响及机制探讨

张春红1，杨帆1，杜锡贤2，范玉2，张欢欢1，张春敏1，韩长玉1

(1山东大学第二医院，济南 250033；2山东中医药大学附属医院)

摘要：目的观察土茯苓提取物落新妇苷对永生化人角质形成细胞HaCaT增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。方法收集对数生长期HaCaT细胞，观察组分别加入不同浓度落新妇苷、空白对照组加DMEM培养液，培养24 h后，采用MTT法测算细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞早期凋亡率；收集对数生长期HaCaT细胞，观察组分别加入不同浓度落新妇苷+20 ng/mL INF-γ、模型对照组加20 ng/mL INF-γ、空白对照组加DMEM培养液培养24 h，采用实时荧光定量PCR法检测细胞中的核转录因子κB (NF-κB)p65、骨桥蛋白(OPN)、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA。结果落新妇苷在25、50、100、200、400 μg/mL时，HaCaT细胞增殖抑制率分别为3.06%、26.53%、40.82%、60.20%及61.22%。落新妇苷在50、100、200 μg /mL时，观察组HaCaT细胞早期凋亡率分别为3.26%、8.24%和15.38%；与空白对照组早期凋亡率(1.33%)比较，P均<0.05。与空白对照组比较，模型对照组NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表达增加(P均<0.01)；与模型对照组比较，观察组随落新妇苷浓度增加，NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表达逐渐降低(P均<0.05)。结论土茯苓提取物落新妇苷能抑制HaCaT细胞增殖、诱导细胞凋亡，其机制可能与制抑细胞NF-κB p65、OPN、VEGF mRNA表达有关。

关键词：银屑病；HaCaT细胞株；核转录因子κB p65；骨桥蛋白；血管内皮生长因子；落新妇苷

银屑病是一种常见的慢性炎症性复发性皮肤病。研究表明[1～3]，VEGF、核转录因子κB(NF-κB) p65和骨桥蛋白(OPN)在寻常型银屑病(PV)患者皮损中高表达，干扰素γ(INF-γ)可促进上述因子的表达。落新妇苷即是从土茯苓中提取的黄酮类化合物。2012年3月～2015年3月，我们以永生化人角质形成细胞株HaCaT(以下简称HaCaT)为研究对象，观察落新妇苷对HaCaT细胞增殖、凋亡及VEGF、NF-κB p65和OPN mRNA表达的影响。

1材料与方法

1.1材料HaCaT，由天津医科大学总医院单士军博士惠赠；落新妇苷标准品购自上海诗丹德生物科技有限公司(批号11/090721，纯度≥98%),将落新妇苷溶入DMSO中，用DMEM稀释配成1 mg/mL混悬液，0.22 μm滤膜抽滤灭菌，-20 ℃贮存备用 ；VEGF、NF-κB p65、OPN及β-actin引物序列，由北京华大基因生物技术有限公司合成；MTT试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均由KeyGEN公司提供；荧光定量PCR试剂由Fermentas公司提供。

1.2细胞培养及传代将HaCaT置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养液，于37 ℃、100%湿度、5%CO2培养箱中单层传代培养，每隔48～72 h更换培养液1次。

1.3细胞增殖抑制率测算采用MTT法。取对数生长期细胞，配成1×104/mL细胞悬液后接种于96孔培养板(200 μL/孔)，分为6组，每组设5个复孔，放在培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后加药；吸弃旧培养基，观察组换用终浓度分别为25、50、100、200、400 μg/mL落新妇苷的新鲜完全培养基继续培养24 h，同时设立空白对照组(加入DMEM培养液)。弃去上清液，用培养液洗3次；每孔加入含MTT 50 μL的培养基，37 ℃再培养4 h；弃上清液，每孔加DMSO 150 μL室温震荡10 min，使结晶物充分溶解；1 h后用全自动酶标仪(波长490 nm)测定各孔吸光度值(A值)，重复3次，取平均值，计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率= (A对照-A观察)/A对照×100%。

1.4细胞凋亡率测算 采用流式细胞仪。取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×106/mL。接种12孔板中，培养24 h；观察组换用含终浓度分别为50、100、200 μg/mL落新妇苷的新鲜完全培养基继续培养24 h，同时设立空白对照组(加入DMEM培养液)。收集贴壁生长的细胞制成单细胞悬液，加入Annexin-V-FITC 和 PI，轻轻混匀后加入细胞；悬浮细胞后避光放置5～15 min，PBS洗1遍；用300 μL PBS重悬细胞，1 h内用流式细胞仪检测细胞早期凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.5细胞VEGF、NF-κB p65、OPN mRNA表达检测采用实时荧光定量PCR法。引物设计[4～6]如下：VEGF上游引物5′-CGCCTGTAATCCCAGCACT-3′，下游引物5′-GCCCGAAGTCATTGAGTA GTC-3′，232 bp；NF-κB p65上游引物5′-CACCACTACATCGT-CCGAGGT-3 ′，下游引物5′-CTCTGCCCCATTTCTCC-CCGT -3 ′，301 bp；OPN上游引物5′-CTCTGAAGAA-ACGGATGACT-3′，下游引物5′-CTGGGATGACCTTGATAGCC-3′，389 bp；内参照β-actin上游引物5 ′-ACCAACTGGGACGACAT-3′，下游引物5 ′-CGCTCGGTGA GGATCTTCAT-3′，389 bp。取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×106/mL。取2 mL接种于25 mL细胞培养瓶中，待细胞长至80%～90%时，观察组更换为含终浓度分别为50、100、200 μg/mL落新妇苷和20 ng/mL INF-γ[7]的新鲜DMEM培养液，另设空白对照组(加DMEM培养液)和模型对照组(加20 ng/mL INF-γ)，置于培养箱中培养24 h。收集细胞，采用TRIzol试剂盒提取总RNA。取10 μL RNA溶液，加990 μL DEPC水稀释，在紫外分光光度计内测定RNA溶液在260 nm及280 nm处的光密度(OD)值。OD260/OD280>1.7时标本可用，否则重新提取。经M-MuLV反转录酶催化合成cDNA，并以此为模板行PCR扩增。反应条件：室温放置10 min，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，-20 ℃保存。荧光定量 PCR 反应过程：采用Promega Sybre Green Supermixture 2×体系，以2-ΔΔCT计算目的基因相对表达量。

2结果

2.1落新妇苷对HaCaT细胞增殖的影响当落新妇苷浓度在25、50、100、200、400 μg/mL时，HaCaT细胞增殖抑制率分别为3.06%、26.53%、40.82%、60.20%及61.22%；400 μg/mL的落新妇苷处理细胞后产生轻微的细胞毒性作用，部分细胞死亡。

2.2落新妇苷对HaCaT细胞凋亡的影响观察组当落新妇苷浓度在50、100、200 μg /mL时，HaCaT细胞早期凋亡率分别为3.26%、8.24%和15.38%。与空白对照组早期凋亡率(1.33%)比较，P均<0.05。

2.3落新妇苷对INF-γ诱导HaCaT细胞VEGF、NF-κB p65、OPN mRNA表达的影响见表1。

表1　各组细胞NF-κB p65、OPN及VEGF mRNA

注：与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；模型对照组比较，cP<0.05，dP<0.01；与50 μg/mL比较，eP<0.05，fP<0.01；与100 μg/mL比较，gP<0.05。

3讨论

银屑病的病因和发病机制尚不明确，新生血管形成是其重要的病理特征之一。VEGF是一种作用最强、最特异的促血管生成因子，可加重银屑病皮损处的炎症反应，促进银屑病的发病过程。OPN是存在于细胞外基质中的一种磷酸化糖蛋白，参与细胞黏附、凋亡、血管形成、炎症反应、肿瘤转移等多种病理过程；其属于Th1型细胞因子，是免疫细胞募集及启动Th1型细胞免疫的关键细胞因子，能促进Th1型反应，在银屑病和肿瘤细胞中均有较高表达。NF-κB是一种核转录调控因子，可调控多种与炎症和免疫有关的基因表达。研究表明，NF-κB可以刺激OPN和VEGF的表达，从而促进角质形成细胞(KC)过度增殖。

土茯苓具有清热利湿、解毒、祛风止痛等功效，为治疗银屑病的常用中药。药理研究证实，土茯苓具有抗肿瘤[8]、抗凝血[9]、抗菌作用[10，12]及调节免疫功能[11]。落新妇苷是土茯苓最主要的单体成分。银屑病表皮过度增殖的KC可分泌一系列细胞因子和炎性因子，参与本病的免疫学发生、发展。INF-γ能明显诱导NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA的分泌，可能与INF-γ作用于HaCaT细胞后，刺激局部炎症反应，使HaCaT细胞分泌细胞因子或炎症因子增加有关。VEGF能呈剂量依赖性地促进KC的增殖和KC的迁移而抑制其黏附[12]。本研究显示，随着落新妇苷浓度升高，HaCaT细胞NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA表达降低。TNF-α、INF-γ能诱导人皮肤KC分泌NF-κB增多，且二氢黄酮类化合物柚皮苷能明显降低细胞培养上清液中TNF-α、INF-γ诱导的趋化因子的分泌，其作用途径之一可能是通过NF-κB信号通路来实现[7]。氧化苦参碱可下调HaCaT细胞NF-κB p65和VEGF表达，且两者呈正相关[13]。而我们的研究结果表明，落新妇苷能抑制HaCaT细胞增殖、诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞NF-κB p65、OPN和VEGF mRNA表达有关。

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Effects of astilbin on cell proliferation and apoptosis of human

keratinocytes HaCaT and the mechanism

ZHAGNChun-hong1, YANG Fan, DU Xi-xian, FAN Yu, ZHANG Huan-huan,

ZHANGChun-min,HANChang-yu

(1TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of astilbin on the cell proliferation and apoptosis of human keratinocyte cell line HaCaT and to investigate the mechanism. MethodsHaCaT cells in the logarithmic phase were selected. The observation group was incubated with different concentrations of astilbin, and the blank control group was cultured with DMEM solution for 24 hours. The proliferation and apoptosis of HaCaT cells were respectively measured by MTT and flow cytometry (FCM). HaCaT cells in the logarithmic phase were selected. The observation group was cultured with different concentrations of astilbin+20 ng/mL INF-γ, the model group was cultured with 20 ng/mL INF-γ and the blank control group was cultured with DMEM solution for 24 hours. Real-time fluorogenetic quantitative PCR (FQ-PCR) was employed to detect the expression of nuclear transcription factor-κB p65 (NF-κB p65), osteopontin (OPN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA.ResultsWhen the concentrations of astilbin were 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL, the proliferation inhibition rates of HaCaT cells were 3.06%, 26.53%, 40.82%, 26.53% and 61.22%. When the concentrations of astilbin were 50, 100, 200 μg/mL, the early apoptosis rates of HaCaT cells in the observation group were 3.26%, 8.24% and 3.26%, respectively. Compared with the blank control group (1.33%), significant difference was found in the early apoptosis rate (all P<0.05). Compared with the blank control group, the expression of NF-κB p65, OPN and VEGF mRNA was increased in the model control group (all P<0.01). Compared with the model control group, the expression of NF-κB p65, OPN and VEGF mRNA was gradually decreased with the increased concentrations of astilbin (all P<0.05). ConclusionAstilbin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HaCaT cells, whose mechanism may be associated with the inhibition of VEGF, NF-κB p65 and OPN mRNA expression.

Key words:psoriasis HaCat cell line; nuclear transcription factor-κB p65; osteopontin; vascular endothelial growth factor; astilbin

收稿日期：(2015-07-12)

通信作者简介：张春敏(1963-)，女，博士,主任医师，主要研究方向为中西医结合治疗皮肤病的临床与基础。E-mail:zhangch1976@163.com

作者简介：第一张春红(1976-)，女，博士,副主任医师，主要研究方向为中西医结合治疗银屑病的临床与基础。E-mail: aliu133@163.com

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(81202700/H2709)；山东省自然基金青年基金项目(ZR2010HQ032)；山东省科技攻关项目(2010G0020231)；山东省中医药科技发展计划项目(2009-164)。

中图分类号：R758.63

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)46-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.007