(黑龙江农业经济职业学院养殖系，黑龙江 牡丹江 157041)

黑龙江省东部地区PRRSV流行毒株NSP2基因序列分析

李晓娟，李树东

(黑龙江农业经济职业学院养殖系，黑龙江 牡丹江 157041)

为了解黑龙江省东部地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行毒株遗传变异情况，对该地区疑似蓝耳病的发病猪进行剖检，采集病料，提取RNA，利用RT-PCR方法进行扩增，成功分离到1株PRRSV毒株，并对其NSP2序列进行测定和序列比对分析。序列分析表明，该分离株具有30个氨基酸缺失的基因特征，利用DNAstar软件进一步分析表明，本分离株与其他毒株国内分离株同源性在97.9%～98.9%之间，与经典毒株亲缘性较差。系统发生进化树可以看出本次扩增PRRS毒株与国内广东分离株亲源关系最近，同属一个小分支。试验分离得到1株PRRS变异毒株，为分析掌握该地区的蓝耳病的遗传变异、流行动态及防控奠定基础。

蓝耳病病毒；NSP2基因；序列分析

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）于1987年首次在美国发现[1]，此后广泛存在于世界各国和地区。我国1996年首次分离到该病毒[2]，2006年夏秋之季，由于蓝耳病病毒的致病毒力发生变化，导致我国部分地区发生高致病性猪蓝耳病疫情，先后波及到多个省份。但由于当时没有有效的预防和治疗的手段，生猪发病死亡率比较高，有超过1 000万头猪在这场疫病暴发中死亡和被销毁，给养猪业造成巨大的经济损失。高致病性猪蓝耳病疫情带给我们的经验教训是早期预警预测、实验室检测等意义重大，因此对于蓝耳病的流行感染情况和毒株的变异情况进行监测，是预防和控制该病最有效的方法。了解蓝耳病流行感染状态，分析流行的优势毒株，有针对性地合理应用疫苗，对进一步更好地防控该病具有深远的意义。

1  材料与方法

1．1 病料来源

采取经猪繁殖与呼吸综合症病毒RT-PCR诊断试剂盒检测阳性的死猪扁桃体、血清、肺脏组织。

1．2 试剂材料

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DEPC水、DL2 000 Marker、总DNA抽 提试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒均购自上海生工生物有限公司，鼠源反转录酶(RevertAidTm M-MuLV Reverse Transcriptase)、RNA酶抑制剂(Ribonuclease inhibitor)购自MBI Fermentas公司，Agarose琼脂糖购自美国基因泰克公司，猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR诊断试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1．3 引物设计与合成

根据GenBank发表PRRSV-NSP2（猪蓝耳病NSP2基因）用Oligo6.0软件设计引物，引物基因序列[3]，预期扩增长度为795 bp：

NSP2-F1：5'-CAA CAC CCA GGC GAC TTC AGA AAT G-3'；

NSP2-R1：5'-CA AGT CAG CAT GTC AAC CCTATC-3'

1．4 病料处理

1）组织样品处理：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1 g，用手术剪剪碎混匀后取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清液100 µL于1.5 mL灭菌离心管中。2）全血样品处理：待血凝后取血清100 µL，置1.5 mL灭菌离心管中。

1．5 病毒 RNA 的提取

1）取已处理的样品加入裂解液 600 µL，充分颠倒混匀，室温静置3～5 min。 2）将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），13 000 r/min离心30 s。3） 弃去收集管中液体，加入600 µL洗液，13 000 r/min离心30 s。 4） 重复步骤3）。5） 弃去收集管中液体，13 000 r/min空柱离心 2 min，以除去残留的洗涤液。6）将吸附柱移入新的1.5 mL离心管中，向柱中央加入洗脱液50 µL，室温静置1 min，13 000 r/min离心30 s，离心管中液体即为模板RNA。

1．6 扩增Nsp2基因

将样品提取的RNA再次进行RTPCR反应，扩增Nsp2基因。20µL反转录体系：2µL模板RNA， 2µL引物Nsp2-R，70 ℃水浴5 min，冰上 2 min； 加 入 4µL 5×reverse transcription reaction buffer，8µL2.5 mmol/L dNTP，1µL Ribonuclease inhibitor(20U)， 灭菌去离子水2µL，混匀，37 ℃水浴5 min；加入1µL (200U) MuLV反转录酶，混匀，42 ℃水浴2 h；70 ℃水浴10 min终止反应。PCR反应体系如下：l0×PCR Buffer 2.5µL，2.5 mmol/ L dNTP 2µL，引物1µL (上下游引物各0.5µL)，cDNA 1µL，rTaqDNA聚合酶0.25µL，补水至25µL。95 ℃预变性 5 min；然后94 ℃1 min、59 ℃40 s、72 ℃50 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。所扩增的片段理论大小约为795 bp。按胶回收试剂盒说明书回收目的片段。将回收的PCR产物目的片段送生物公司进行序列测定。

1．7 序列分析

应用 DNAStar软件将分离株的NSP2序列与已公布的参考毒株序列进行比对分析，分析基因同源性并绘制系统进化树。

2  结果与分析

2．1 NSP2基因扩增结果

应用设计引物对NSP2基因进行扩增，可见到795 bp左右的基因条带，大小与预期基因相符（图1）。

2．2 测序与核苷酸比对结果

将NSP2基因回收送基因测序公司进行测序，结果得到795 bp的序列，命名为MDJ-1测序结果比对发现与经典毒株相比有90碱基的缺失，符合基因缺失型猪蓝耳病的特征，结果如图2。

2．3 核苷酸同源性比较结果

测序结果表明，本研究成功地从送检病料中扩增出本地区PRRS病毒Nsp2基因，利用DNAstar软件进一步分析表明，本分离株与其他毒株国内分离株同源性在97.9%～98.9%之间，与经典毒株亲缘性较差。

从系统发生进化树可以看出本次扩增PRRS毒株与国内广东分离株亲源关系最近，同属一个小分支，并且同属于Nsp2基因缺失型蓝耳病病毒。

3  讨论

图1 Nsp2基因扩增结果

图2 本分离株与其他PRRS毒株的核苷酸序列比对

图3 本分离株与其他PRRS毒株的核苷酸同源性比较

图4 Nsp2基因系统进化树结构图

PRRSV为单股正链RNA病毒，是变异率较高的RNA病毒，基因组长约15 kb，含有9个开放阅读框，线性排列顺序为5′-ORF1a/1b-ORF2-Gp3-Gp4-Gp5-M-N-3′，病毒基因组的每个读码框都和相邻的有部分重叠[4]。PRRSV最主要的非结构蛋白是Nsp2，具有3C样半胱氨酸蛋白酶区域，该区域的功能是Nsp2蛋白研究的热点。Nsp2蛋白编码区氨基酸序列具有很高的变异性，但不论是欧洲株还是北美株的Nsp2蛋白都包含大量线性B细胞抗原决定簇，表明Nsp2蛋白是机体感染PRRSV后能够引起机体抗体应答的免疫活性蛋白，同时Nsp2蛋白具有细胞和组织嗜性，与病毒的复制复合体的形成有关。ORF1a中的NSP2基因是PRRSV高变基因之一。有研究表明NSP2基因突变与缺失可能影响病毒对组织和细胞的嗜性，也可能与病毒感染有关。2006年暴发的高致病性猪蓝耳病给我国养猪业造成了巨大的经济损失，NSP2基因存在不连续的30个氨基酸的缺失为基因特征，因而推测该30个氨基酸的缺失可能是引起毒力增强的原因。而有研究表明，30个氨基酸的缺失与其毒力增强无关。本试验成功扩增到1 株毒株PRRS-NSP2基因，应用 DNAStar 软件对分离的毒株和参考毒株进行了序列比对分析，结果表明，分离株具有基因缺失的特征，另外也存在有散在不规律的碱基和氨基酸的突变，证明本地区仍然存在蓝耳病的流行。

[1] Bilodeau R， Dea S， Sauvageau R A， et al.‘Porcine reproductive and respiratory syndrome’in Quebec[J]. Vet Rec. 1991，129(5)： 102-103.

[2] 夏伟，袁远，张宇辉，等.高致病性蓝耳病临床案例分析与防治策略[J].养猪，2014（4）：89.

[3] 孙明，涂长春，李红卫，等.应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测I.JEV、PPV、PRRSV、PRV多联PCR引物设计[J].中国兽医学报，2000，20（1）：10-14.

[4] 朴明淑，蔡锦顺，鲁承，等.猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒延边地区地方株的分离鉴定[J].江苏农业科学，2013，41（1）：208-210.

2014-12-29）

黑龙江省教育厅高职高专科学研究项目，“黑龙江省东部地区猪蓝耳病动态研究”项目编号：12525074

李晓娟，女，汉族，讲师，硕士研究生，出生年月1982年1月。研究方向：分子免疫学