文∕杨宇泽 冯 涛 肖 炜 靳月生 路永强

（1北京市畜牧总站；2北京市农林科学院畜牧兽医研究所；3北京市昌平区农业局）

牛白细胞黏附缺陷症（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD）是一种发生在荷斯坦牛群中的遗传性免疫缺陷病，是一种由常染色体上单基因控制的隐性遗传疾病。患病牛只临床表现为严重的重复性感染、脓液形成减少、伤口愈合延迟和白细胞增多，也表现为犊牛初生重低和发育不良等症状。BLAD最早由Hagemoser等[1]发现，该病在日本、美国、丹麦、荷兰、德国、瑞士、土耳其、中国[2，3]、印度[4]、捷克[5]等国均有发生。

BLAD是由于牛1号染色体上编码整合素β亚单位（CD18）的第383位碱基由A突变为G，使与之相应的位于胞外高度保守区的第128位天门冬氨酸变成了甘氨酸，最终导致白细胞表面整合素的β2亚单位表达明显减少或缺乏而引起的临床发病。该突变导致CD18基因上TaqI酶切位点的消失。据此，通过检测北京郊区荷斯坦母牛CD18A383G基因型，为进行遗传改良和淘汰含BLAD基因的奶牛个体提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采集北京市延庆县A奶牛场、B奶牛场及昌平区C奶牛场共502 份健康荷斯坦母牛抗凝血样，利用血液基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）抽提血液基因组DNA。

1.2 方法

根据Genbank中牛CD18（NM_175781）基因序列，用Primer 5.0软件设计引物，引物序列为：F：5′-CAGGTCAGGCAGTTGCGTTCAAT-3′；R：5′-GGTTTCAGGGGAAGATGGA GTAG-3′。PCR产物大小206 bp，位于CD18基因第二外显子区。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，64 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸7 min。

对502 份荷斯坦母牛血液基因组DNA 进行PCR 反应，对PCR反应产物进行酶切，经Taq I（Takara）酶切后理论上可以呈现3 种基因型，即野生型（AA）150/56 bp、杂合型（AG）206/150/56 bp和突变型（GG）206 bp。酶切后的杂合型和突变型个体全部经PCR产物测序再次确认，以确保结果准确无误。

2 结果

在检测的3 个奶牛场中，延庆A奶牛场未检测到携带BLAD基因的个体；延庆B奶牛场中检测到2头携带BLAD杂合基因个体；昌平C奶牛场中检测到3 头携带BLAD基因的杂合个体。杂合子个体PCR产物序列测定结果见图1，图中最中间的碱基测序图呈现2 个明显的波峰，其中绿色的峰代表A碱基，黑色的峰代表G碱基，即表示在该位点为杂合子突变。在3 个奶牛场中共检测到2 种基因型，AA和AG，未检测到GG基因型。检测群体中BLAD基因的携带率为3.1%。图2为荷斯坦牛CD18基因PCR-RFLP检测的琼脂糖凝胶电泳图。表1为3 个奶牛场奶牛BLAD基因频率统计分析。

图1 AG 杂合子个体PCR 产物序列测定结果

图2 荷斯坦牛CD18 基因PCR-RFLP 检测琼脂糖凝胶电泳图

表1 3 个奶牛场奶牛BLAD 基因频率统计分析

3 讨论

牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）纯合子基因突变可导致犊牛早期死亡，严重影响了奶牛的育种生产成本，降低了奶牛生产效率。但由于该突变基因为隐性遗传，一般常规的方法无法确定病症。因此，用分子检测手段对奶牛群进行牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）突变基因检测尤为重要。

李艳华等[2]检测了北京市荷斯坦公牛BLAD基因，发现了1 头BLAD基因携带者，BLAD基因的检测率为1.9%（1/54）。王洪梅等[3]检测了济南市周边11 个奶牛场356 头荷斯坦母牛和山东奥克斯荷斯坦奶牛公牛站的53 份公牛冻精，结果发现有3 头母牛携带BLAD基因，检出率为0.8%，公牛均不携带BLAD基因。王洪梅等[6]对天津和山东的荷斯坦母牛进行了检测，BLAD基因的携带率为0.69%（3/436）。近期，李艳华等[7]检测了北京奶牛中心246 头荷斯坦公牛和北京地区高产奶牛群409 头母牛，结果发现公牛群BLAD基因携带率为0.41%，母牛群BLAD基因携带率为3.91%。

综合以上研究可以看出，北京市荷斯坦牛群体中公牛BLAD基因的携带率较六七年前有所降低，但还没有达到彻底净化的程度，特别是在母牛群中，携带者频率长期达到3.0%以上。此外，本研究中荷斯坦母牛BLAD基因携带率与李艳华等[7]研究结果相似，说明在京郊地区规模化奶牛场使用的公牛冻精中BLAD基因没有得到彻底净化，导致母牛群体中BLAD基因携带率在3%以上。所以在奶牛育种和生产中，应有计划地淘汰携带BLAD基因的个体，净化京郊荷斯坦牛群体。

[1]Hagemoser W A，Roth J A，Lofstedt J，et al.Granulocytopathy in a Holstein heifer.J Am Vet Med Assoc，1983，183（10）：1093-1094.

[2]李艳华，张胜利，韩广文，等.利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺陷症方法的建立.遗传，2007，29（12）：1471-1474.

[3]王洪梅，李建斌，高运东，等.中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症基因检测方法的建立与应用.河北保定：中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集.2006：417-420.

[4]Patel R K，Singh K M，Soni K J，et al.Low incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency（BLAD）carriers in Indian cattle and buffalo breeds.J Appl Genet，2007，48（2）：153-155.

[5]Citek J，Rehout V，Schröffelová D，et al.Frequency of BLAD and CVM alleles in sires and elite heifers of Czech Holstein cattle.Dtsch Tierarztl Wochenschr，2008，115（12）：475-477.

[6]李艳华，朱玉林，张胜利，等.北京地区荷斯坦牛BLAD遗传缺陷基因的分子筛查.中国奶牛，2013（1）：17-20.

[7]王洪梅，李建斌，许尚忠，等.中国荷斯坦牛白细胞黏附缺陷症PCRRFLP检测.生物技术通报，2007（3）：155-159.