王鑫，王淑红(集美大学水产学院，福建厦门361021)

性别决定与性腺发育一直都是现代生物学研究的重要领域之一，它们是彼此紧密联系的2个过程:性别决定首先确定了个体性腺发育的方向，性腺发育在性腺分化的基础上，经过遗传、环境、生理等因素复杂的相互作用，最终发育成成熟的精巢和卵巢［1］。性别决定与性腺发育的作用机制可以归纳成2种类型:一类为遗传决定系统(Genetic sex-determination system，GSD)，即由遗传因素决定性别，主要指性染色体和性别决定基因的调控;另一类为环境决定系统(Environmental sex-determination system，ESD)，即周围环境因子的调控，主要是性激素、环境因子等外部因素的作用。软体动物性别决定与性腺发育的分子机制尚未明确，该过程相关的基因也尚未得到证实［2－6］，加上绝大多数软体动物尚未发现性染色体和性别决定基因，因此软体动物性腺发育的作用分子机制可能是环境决定系统。

在20世纪，研究人员已经发现性激素包括雌二醇、睾酮和孕酮广泛存在于腹足类［6－8］和双壳类［9－10］等软体动物中。Osada等［11］和Li等［12］研究发现在双壳类生物体内注射雌二醇能促进卵黄的生成并调节排卵过程。Varaksina等［13］报道在虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)体内注射雌二醇、睾酮和孕酮后能刺激成体样品的卵子发生和精子发生，导致卵母细胞直径的增长以及性腺重量的增加。但是，Scott［3－4］综述了200多篇主张软体动物存在脊椎动物类型类固醇激素观点的学术论文，指出目前没有确切证据表明软体动物能够合成脊椎动物类型的类固醇激素。因此，尽管软体动物体内存在类似于脊椎动物的雌激素和雄激素，但由于缺乏对其生物合成途径或来源的了解以及有关激素受体的直接证据，脊椎动物类型的类固醇激素在软体动物性腺分化中的作用仍是一个未解之谜。

维甲酸X受体是核受体家族重要的组成成员，其主要功能是作为转录因子来参与生物发育、细胞分化、新陈代谢以及细胞凋亡过程。RXR还是孤儿受体家族的一员，目前还没有找到RXR的天然配体。软体动物RXR基因的相关研究已经越来越受到重视。2004年，Nishikawa等［14］研究发现TBT与TPT能改变人RXR的表达水平;Castro等［15］在对狗岩螺的试验中发现性畸变的诱导是由RXR信号途径调控的。2011年，Horiguchi等［16］向疣荔枝螺注射了9cRA，通过实时荧光定量PCR技术检测发现TcRXR的mRNA水平在性畸变个体的阴茎和输精管显著上升，这说明RXR参与了有机锡致疣荔枝螺性畸变的过程。这表明RXR基因确实参与了TBT等有机锡化合物调控软体动物性腺发育的过程。

杂色鲍(Haliotis diversicolor)，属于腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaeogastropoda)、鲍科(Haliotidae)、鲍属(Haliotis)，是我国南方重要经济贝类之一，阐明杂色鲍性腺发育的分子机制对于杂色鲍的健康养殖有着重要的意义。笔者以杂色鲍为研究对象，采用实时定量PCR技术研究RXR基因在杂色鲍性腺发育不同阶段的表达情况，确认杂色鲍性腺分化的关键窗口期。然后，采用RNA干扰技术，在杂色鲍性腺分化的关键时期沉默RXR基因、RXR基因以及细胞凋亡相关基因在杂色鲍性腺分化与发育中的作用。

1 材料与方法

1．1 试验动物 试验用杂色鲍购自于厦门市翔安区培阳水产养殖公司并放养在培阳水产养殖公司，每天都由养殖公司工作人员喂养新鲜江蓠(Gracilaria verrucosa)，海水温度控制在25℃左右。每月解剖样本时挑选重量一致、附着力强的健康鲍鱼。解剖鲍鱼时，分别采集头部组织、肝胰腺组织以及性腺组织，液氮速冻后置于－80℃冰箱保存备用。

1．2 dsRNA的合成 以Trizol法提取杂色鲍总RNA并通过反转录得到的线性化cDNA为模板，通过PCR技术扩增了杂色鲍RXR基因的干扰片段，然后通过目的基因与质粒载体连接、感受态细胞的转化和筛选、质粒插入片段的检测、质粒测序等步骤制备得到合成dsRNA所需的线性化DNA。采用体外转录法合成dsRNA。0．5 ml PCR管加入以下反应体系:1 μg 线性化的 DNA、20 μl 10 × 转录缓冲液、10 μl 10 mmol/L ATP、10 μl 10 mmol/L CTP、10 μl 10 mmol/L GTP、10 μl 10 mmol/L UTP、1 μl RNase inhibitor、2 μl RNA polymerase、5 μl 0．1 mol/L DTT，加入 DEPC 水至 100 μl。试验完成后，取少量样品用1．2%琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的质量，同时用紫外分光光度计检测dsRNA的浓度。剩余的样品加入1 μl RNase inhibitor，－80℃下保存备用。

1．3 RNA干扰试验 将暂养7 d的杂色鲍分成3组:第1组在鲍鱼肝胰腺的中间部位注射1．5 μg/b．w．的灭菌海水;第2组在鲍鱼肝胰腺的中间部位注射1．5 μg/b．w．的dsRNA-EGFP;鲍鱼肝胰腺的中间部位注射 1．5 μg/b．w．的 dsRNA-RXR。注射完成后将鲍鱼放回之前的缸中放养。48 h后解剖鲍鱼进行RNA提取。

1．4 实时定量PCR试验 实时定量荧光PCR反应体系(10 μl):SYBR Green PCR Master Mix 5 μl、上游引物 F 0．5 μl、下游引物 R 0．5 μl、cDNA 模板 4 μl。

实时定量荧光PCR反应程序:95℃预热5 min;95℃变性15 s，60℃退火1 min，40个循环;最后，进行溶解曲线分析:95℃ 5 s，65℃ 1 min，从65℃升温至97℃(每10 s上升0．11 ℃)。

定量的结果采用 LightCycler®480Software1．5分析，运用Pfaff法(RQ=(1+E)△Cq，△Cq=最小的Cq值分别减去各组织样本的Cq值，E为不同基因引物的扩增效率)，并使用SPSS19．0统计软件进行单因素方差分析，用RQ值表示基因的表达水平。

2 结果与分析

2．1 杂色鲍卵巢发育过程中RXR的表达变化 根据前期对杂色鲍性腺石蜡切片的显微镜观察结果(性腺的颜色、体积、生殖细胞的形态结构及占主体的生殖细胞的类型等)，将杂色鲍的性腺发育周期分为4个时期:休止期、增殖期、生长期、成熟期。根据前期对杂色鲍卵巢内参基因的筛选，将OAZ1作为卵巢内基因相对表达的最适内参。

从图1可以看出，在卵巢组织中RXR基因在性腺发育增殖期和生长期的表达量显著上调(P＜0．05);此后，在性腺发育成熟期和休止期的表达量显著下调。在雌性杂色鲍头部组织中，RXR基因在性腺发育的增殖期表达量显著上调(P＜0．05);在性腺发育生长期、成熟期和休止期表达量显著下调。在雌性杂色鲍肝胰腺组织，RXR在性腺发育的增殖期时表达量显著上调(P＜0．05);在性腺发育生长期、成熟期和休止期时表达量显著下调。在雄性杂色鲍头部组织，RXR基因在性腺发育的增殖期时表达量显著上调(P＜0．05);在性腺发育生长期、成熟期和休止期时表达量显著下调。在雄性杂色鲍肝胰腺组织中，RXR基因在性腺发育生长期的表达量显著上调(P＜0．05);在性腺发育成熟期时表达量显著下调表达;在性腺发育休止期时表达量呈上升趋势;在性腺发育增殖期，表达量显著下调。

2．2 RXR基因的RNA干扰结果 为了检测RXR基因沉默对雌性杂色鲍RXR基因的表达的影响，利用荧光定量PCR技术分析RXR基因沉默后样品中RXR基因的mRNA表达水平。从图2可以看出，在雌性个体头部组织中，处理组RXR基因表达水平与空白对照组以及阴性对照组相比无显著性差异。从图3可以看出，在雌性个体卵巢组织中，处理组RXR基因表达水平与空白对照组以及阴性对照组相比显著性下降(P ＜0．05)。

3 讨论

在脊椎动物中，RXR基因参与多种重要的生理过程，包括胚胎发育、细胞增殖与分化、新陈代谢等。脊椎动物体内的RXR有3种亚型(α、β、γ)，能够与维生素D受体、甲状腺激素受体、过氧化物酶体增殖物激活受体、胆汁酸受体等核受体形成异源二聚体发挥调控作用［17］。在甲壳类动物体内，RXR基因能与蜕皮激素形成异源二聚体［18］。目前，关于软体动物RXR基因的研究主要集中在TBT等有机锡化合物诱导RXR的非正常表达，进而导致性畸变现象［19］。在性畸变后期，由于卵巢内输精管的产生导致输卵管阻塞以及卵巢内的精子发生，受到性畸变影响的软体动物都会出现性腺发育不良的现象，进而出现种族繁育危机［20－22］。笔者主要研究RXR基因在杂色鲍性腺发育过程中的表达情况，结果发现RXR在卵巢、雌性个体头部组织、雌性个体肝胰腺组织、雄性个体头组织和雌性个体肝胰腺组织的表达量在增殖期均存在显著差异，这证实了RXR不仅在脊椎动物体内参与了细胞增值与分化的过程，在软体动物体内同样存在该作用，同时也表明增殖期可能是RXR基因在杂色鲍性腺发育过程中起调控作用的的窗口期，为后面的RNA干扰试验提供了基础。同时，在雄性个体肝胰腺组织，RXR基因在性腺发育增殖期时表达量显著下调，这与其他组织的表达情况不同，说明在雄性杂色鲍体内RXR基因在不同组织发挥调控作用的时间点不同，也可能RXR基因在性腺发育过程中有其他作用。

RNA干扰技术能够快速有效沉默某个基因的表达，进而影响该基因的功能作用。目前，RNA干扰技术已经广泛地应用在脊椎动物与非脊椎动物中。但是，在软体动物中，这项技术还处于初步完善的阶段。有些腹足类生物神经系统的研究和头足类触手肌肉的分化的研究已经使用该项技术;对于双壳类生物，Fabioux等［5］通过对牡蛎性腺注射vasa-like双链RNA，结果表明注射后的牡蛎生殖细胞不在分化并且过早的出现减数分裂过程，甚至出现不育现象。笔者通过对雌性杂色鲍肝胰腺中间部位注射RXR双链RNA来检测RXR基因mRNA的表达水平。结果表明，在雌性个体头部组织中处理组RXR基因表达水平与空白对照组以及阴性对照组相比无显著性差异;在雌性个体卵巢组织中，处理组RXR基因表达水平同空白对照组以及阴性对照组相比显著性下降(P＜0．05)。在卵巢中RXR基因表达的显著性下调，说明RXR双链RNA体外注射能有效沉默卵巢中RXR基因的表达;雌性个体头部组织中的RXR表达量没有变化可能有2个方面的原因:注射到取样间隔时间(48 h)较短，以至于沉默效果还未在雌性个体头部组织中发挥作用，或者是因为RXR双链RNA在未到达目的组织的时候已经被降解。

综上所述，笔者研究了RXR基因在杂色鲍性腺发育中的周年表达情况。这些研究结果有助于阐明杂色鲍性腺发育的分子机制，进一步丰富了软体动物繁殖生物学和水产养殖学的知识，并为软体动物的性腺分化与发育分子机制的研究提供了理论依据。

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