万军 车云 康宁宁 柴惠平

安徽医科大学第一附属医院普胸外科，合肥 230022

小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是肺癌的常见基本类型之一，约占20%，其癌细胞生长迅速，易转移扩散，并且有三分之二的肺癌患者在诊断时就已存在远处转移。SCLC以全身化疗为主，但其治疗水平在近30多年来一直处于平台期[1-2]。多项研究从分子水平证实，SCLC的发生可能涉及多种因子的参与[3-5]。虽然SOCS3和PYK2与肿瘤发生发展间的关系正日益受到关注[6-8]，但目前尚无文献报道SOCS3和PYK2在SCLC中表达和机理方面的内容。

因为实体肿瘤过快的增殖生长方式与其血管生成不成比例，肿瘤内部普遍存在缺氧的情况。现有的动物实验和临床观察虽已证实缺氧是恶性肿瘤进展的主要负面因素，但其具体作用机制尚未明确[9-10]。HIF-1是具有转录活性的核蛋白，主要由α和β两个亚单位组成，一般情况下α亚单位是主要的调节因子。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，只有在缺氧条件下才被稳定表达，并发挥转录和基因调控作用[11]。近十年的研究显示，HIF-1α和SOCS在人类许多常见的肿瘤中都有表达，它们调节肿瘤生物学的各个方面，如细胞生存、增殖、血管生成等[12-13]，从而成为非常引人瞩目的抗癌药物研发目标。本研究主要探讨在SCLC进展过程中SOCS3与PYK2信号通路的关系及对HIF-1α表达和细胞增殖潜能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

6周龄雄性裸鼠24只，体重为19～23 g（中科院上海实验动物中心提供）；人小细胞肺癌细胞株NCI-H446购自上海北诺生物科技有限公司；HIF-1α、SOCS3、PYK2和Tyr402单克隆抗体购自上海汉恒生物科技有限公司；RPMI 1640培养基、异硫氰酸荧光素（FITC）和RNase A酶购自上海博升生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2..11转染细胞的制备 收集对数生长期的人小细胞肺癌株NCI-H446细胞，室温下200 r/min离心5 min；然后用RPMI 1640培养基（0.5%的FCS）重悬细胞，200 r/min离心5 min，弃上清。用电穿孔缓冲液重悬细胞，将细胞浓度调整为每毫升2×106个，孵育20 min；加入质粒或其他载体后混匀，使终浓度为25μg/ml。将800μl细胞悬液移入4 mm电击杯内，使细胞悬浮并避免气泡；给予电击。电击参数为620 V持续60μs，脉冲1次；电击后15 min内将细胞小心地转移至含3 ml RPMI 1640培养基（10%的FCS）的培养皿中，48 h后检测。利用此方法分别制备Ad5转染细胞株、Ad5-SOCS3转染细胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染细胞株。

1.2..22免疫荧光检测 使用红色荧光标记，在倒置荧光显微镜下，分别检测已转染细胞株及未转染细胞株中SOCS3的表达水平。

1.2..33细胞生长曲线的绘制 将人小细胞肺癌株NCI-H446细胞、Ad5转染细胞株、Ad5-SOCS3转染细胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染细胞株分别移至培养基中培养，于第4、8、12、16、20、24、28天使用细胞计数板分别计算细胞增殖数。检测SOCS3单独转染及SOCS3与HIF-1α共转染对细胞增殖的影响。

1.2..44建立实验用裸鼠移植瘤模型 24只裸鼠被随机分为Ad5转染对照组、Ad5-SOCS3单独转染组和Ad5-SOCS3-HIF-1α共同转染组，每组8只。于裸鼠背侧近右前肢处，皮下注射对数生长期的NCI-H446小细胞肺癌细胞株，总量为200μl，为含1×107个悬浮细胞的无血清RPMI 1640培养液。观察并记录各组裸鼠移植瘤的生长速率，定期测量肿瘤体积，计算肿瘤生长抑制率，绘制肿瘤生长曲线图。28天后，脱颈处死所有裸鼠，称重比较瘤体。

1.2..55蛋白印迹法检测表达情况 采用蛋白印迹法检测HIF-1α、SOCS3、PYK2及其磷酸化活性形式Tyr402在裸鼠移植瘤中的表达情况。首先裂解悬浮细胞样品，抽提目的蛋白质；然后在100 V、120 min的条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；再次于15 mA硝酸纤维素膜转膜过夜；最后封闭、一抗孵育、二抗孵育，使用X光片自动洗片机显影检测蛋白表达情况。

1.3 统计学分析方法

电泳产物及蛋白印迹产物采用半定量的方法获得数据。采用SPSS 12.0统计软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较选用SNK法检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后SOCS3的表达情况

使用Ad5-SOCS3转染小细胞肺癌细胞株NCI-H446。经细胞爬片并使用免疫荧光标记SOCS3（红色）后，研究者于倒置显微镜下发现Ad5-SOCS3转染前后SOCS3蛋白的表达水平存在明显差异，转染后细胞胞质的SOCS3蛋白表达水平明显升高（图1A和图1B）。以未转染的人小细胞肺癌细胞株NCI-H446为空白对照组，以单纯转染Ad5的细胞为阴性对照，以转染了Ad5-SOCS3的细胞为阳性组，以各组的β-actin蛋白表达情况为内对照，采用蛋白印迹法检测三组细胞中SOCS3蛋白的表达情况。结果显示，Ad5-SOCS3转染组中SOCS3蛋白表达水平显著高于Ad5组和空白对照组，Ad5组中SOCS3蛋白表达水平明显高于空白对照组（图1C和图片1D，均p＜0.05）。

2.2 裸鼠模型皮下移植瘤生长情况

从培养皿传代转染的细胞开始，每4天计数一次细胞增殖数量，至第28天结束观察计数，Ad5转染组、Ad5-SOCS3转染组和Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组的细胞增殖情况存在明显差异，其中Ad5-SOCS3转染组的细胞增殖速率最慢、Ad5转染组的细胞增殖速率最快、Ad5-SOCS3-HIF-1α转染组的细胞增殖速率居中但更接近Ad5转染组，Ad5-SOCS3转染组和Ad5转染组的细胞增殖速率相比差异具有统计学意义（图2A，p＜0.05）。

将Ad5转染组、Ad5-SOCS3转染组和Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组的细胞接种于裸鼠皮下，每4天测量一次皮下肿瘤的生长情况，至第28天结束观察测量。三组裸鼠皮下移植瘤生长情况与各组细胞在培养皿中的增殖情况一致（图2c），至第28天取出裸鼠皮下移植瘤，Ad5转染组皮下移植瘤的平均体积最大、平均质量最大，Ad5-SOCS3转染组皮下移植瘤的平均体积最小、平均质量最小，Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组的皮下移植瘤的平均体积和平均质量均居中；三组裸鼠28日皮下移植瘤肿瘤质量存在显著性差异（F=59.825，P=0.000；图2B、图2D和表1）。三组裸鼠皮下移植瘤肿瘤质量SNK法进行组间比较显示，每两个比较组间的差异均有统计学意义（均P=0.000）。

表11 三组裸鼠模型第2828天时皮下移植瘤质量比较

2.3 Ad 5-SOCS3转染及干预对HI F-1α和PYK2表达的影响

2 2..3.1 转染SOCS3后HI F-1α和PYK2表达的比较 在未转染SOCS3和（或）HIF-1α的小细胞肺癌细胞株（Ad5转染组）中，HIF-1α、PYK2及其磷酸化活性形式Tyr402的表达情况如图3第1泳道所示。与第1泳道相比，Ad5-SOCS3转染组（图3第2泳道）、Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组（图3第4泳道）中HIF-1α的表达水平明显下降，其中SOCS3转染组HIF-1α的表达水平下降最明显，Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组HIF-1α的表达水平明显高于Ad5-SOCS3转染组，差异均具有统计学意义（均p＜0.05）。Ad5-SOCS3转染组和 Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组的PYK2和Tyr402表达水平基本一致，但均明显低于未转染组，差异均具有统计学意义（均p＜0.05）。

22..3.2特异性干预对HIF-1α和Tyr Tyr 402402表达的影响 PYK2特异性小干扰组（siPYK2组，图3第3泳道）的HIF-1α表达水平明显低于未转染组，且Tyr402的表达水平同样低于未转染组。

3 讨论

SOCS3是SOCS家族成员之一，能够阻断细胞因子应答并负反馈调节信号传导子和转录激活子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的信号通路，在抑制细胞过度增殖、诱导凋亡、维持细胞内环境稳态等方面发挥重要作用[14-15]。SOCS3在多种肿瘤中的表达均下调，与恶性肿瘤的发生发展关系密切。据推测，SOCS3表达上调可能参与某些肿瘤细胞对肿瘤生长抑制因子的应答。在本研究中，与未转染Ad5-SOCS3的情况相比，Ad5-SOCS3转染后，小细胞肺癌细胞株及其裸鼠皮下移植瘤的增长速率均下降，其中以Ad5-SOCS3转染组小细胞肺癌细胞株及其裸鼠皮下移植瘤的增殖速率明显且低于Ad5转染组和Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组，而Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染对细胞株和皮下移植瘤的影响较小。这提示Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染可削弱Ad5-SOCS3单独转染对细胞增殖的抑制作用。从第28天移植瘤质量的比较来看，Ad5-SOCS3单独转染组的移植瘤质量明显小于Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染组的，而共转染组的移植瘤质量又明显小于Ad5转染组的。这提示SOCS3基因对小细胞肺癌细胞株NCI-H446中PYK2介导的HIF-1α的信号通路及细胞增殖有负性调控作用，且Ad5-SOCS3-HIF-1α共转染或siPYK2技术仅可在一定程度上抑制这种负性调控，使HIF-1α的表达较Ad5-SOCS3单独转染时升高，但其表达无法达到未转染SOCS3时的水平。因此，SOCS3基因有可能成为小细胞肺癌基因治疗的一个新的靶点。

PYK是一种非受体酪氨酸激酶，在细胞内分布广泛，与细胞内多种信号传导通路及其生物学功能密切相关，调节细胞存活、增殖和迁移。PYK2信号通路的活化能够增强细胞运动并促进细胞在非锚定状态下的存活[16]。多项研究发现，高侵袭性肿瘤细胞存在PYK2蛋白表达上调和（或）活性增强的现象。目前，对PYK2的研究主要集中在病理生理过程中其多个磷酸化位点活性的变化及其对下游靶蛋白磷酸化作用的方面。其中，酪氨酸402位点（Tyr402）是PYK2最重要的自身磷酸化位点，为PYK2活化和功能所必需，其磷酸化后可以增强乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力，可能在促进肿瘤转移方面具有重要作用。对肝癌组织的研究显示，PYK2高表达者多为晚期肝癌患者，而动物实验显示PYK2过表达可见于侵袭边缘的肿瘤细胞和肺转移结节中[17]。虽然PYK2广泛表达于正常胃黏膜，但其在胃癌组织中的表达显著降低，且胃癌组织学分级和TNM分期越高PYK2表达就越低。这表明PYK2蛋白在不同肿瘤中的表达情况并不相同，对不同肿瘤发生发展的作用可能也不同。对肺癌的研究显示，PYK2是参与悬浮生长肺腺癌细胞的生存和神经肽诱导的小细胞肺癌细胞增殖信号通路的关键效应分子。

越来越多的研究显示PYK2对多种肿瘤的发生发展均具有非常重要的作用。在转移性和侵袭性的神经胶质瘤和肝癌细胞中PYK2的表达显著增强。侵袭性乳腺癌细胞和小细胞肺癌细胞中均可检测到PYK2蛋白Tyr402位点的磷酸化，而且PYK2相关途径的活化参与人类肿瘤细胞黏附能力的上调。尽管已有大量关于PYK2下游信号通路的研究，但是有关PYK2的调节机制目前尚不明确。在我们的研究中，与未转染SOCS3的细胞相比，Ad5-SOCS3转染细胞中PYK2的表达水平及Tyr402的表达水平均明显下降，其效果与si-PYK2技术产生的效果相同，提示SOCS3蛋白可能具有负性调节PYK2表达的作用，可能是PYK2信号通路中非常重要的负性调节因子。

不过，SOCS3与PYK2间的相互作用是否通过磷酸化的Tyr402位点以及SOCS3对PYK2下游与细胞迁移相关的细胞骨架蛋白的调节是否与肺癌转移有关等问题均仍需进一步验证。

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