张乃锋 王 杰 崔 凯 沈 陈 祁敏丽柴建民 单瑛琦 刁其玉

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京 100081;2.北京大兴区动物卫生监督管理局，北京 102600)

益生菌作为抗生素促生长剂的替代物之一已广泛应用于生猪饲粮中，与抗生素促生长剂不同的是益生菌是通过改变肠道菌群平衡而对动物产生益生作用。许多学者对益生菌在生猪饲粮中作为促生长剂的功效作了评估，在仔猪饲粮中无论是单独补充乳酸菌［1-4］或补充乳酸菌与其他益生菌的复合物［5］均能够显著改善仔猪的生长性能。然而，在生长肥育猪饲粮中补充乳酸菌的效果报道并不一致，如Chen等［6-7］在生长猪饲粮中添加乳酸菌和芽孢杆菌的复合物，显著提高了生长猪的平均日增重。而张董燕等［8］的研究表明，在生长猪饲粮中添加猪源唾液乳杆菌对生长猪平均日增重无显著影响。这种差异性可能是由于益生菌菌株和用量的差异或饲粮配方、饲养管理的差异及益生菌与其他饲料成分之间相互作用等因素造成的［9］。植物乳杆菌GF103是本实验室分离提取的一株益生菌，具有提高饲料营养物质消化率［10］、降低仔猪粪便中大肠杆菌数量，增强免疫力的作用［11］，但在生长育肥猪饲粮中的应用效果尚不清楚。本试验旨在研究益生菌(植物乳杆菌GF103)替代饲粮中抗生素促生长剂对生长猪生长性能、营养物质消化率及粪中微生物数量的影响，从而为益生菌在生长猪养殖中的应用提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物乳杆菌GF103:由中国农业科学院饲料研究所家畜研究室制备，经16S rRNA基因序列分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，活菌数≥2×109CFU/g。经体外益生效果评价得知，植物乳杆菌GF103在pH=3的条件下活菌数较高，能够耐受0.3%胆盐;在人工模拟胃液中培养0.5 h活菌数不受影响(P＞0.05)，培养3 h活菌数(lg CFU)降低1(P＜0.01);在人工模拟肠液中培养3 h活菌数不变(P＞0.05)。表明植物乳杆菌GF103具备益生菌特性，可进一步研究其作为微生物添加剂在动物上的应用效果［12］。

1.2 试验动物及分组

采用单因素随机区组设计。选择平均体重(26.36±1.93)kg的生长猪 300 头，分为 15 个栏位饲养，每栏20头猪，每栏内生猪日龄一致、公母各占1/2。根据生猪日龄分为3个区组［分别为(74.0±4.7)日龄、(92.4±5.7)日龄和(107.0±5.6)日龄］，每个区组 5个栏位，利用 SAS 9.2的Proc Plan程序设计随机区组方案，将每个区组的5个栏位随机分配到5个组中，形成每组3个重复，每重复20头生长猪的设计方案。试验5个组分别为:对照(CON)组，饲喂基础饲粮;抗生素(PC)组，饲喂基础饲粮+40 mg/kg杆菌肽锌;试验1(T1)组，饲喂基础饲粮+1×109CFU/kg植物乳杆菌;试验2(T2)组，饲喂基础饲粮+5×109CFU/kg植物乳杆菌;试验3(T3)组，饲喂基础饲粮+1×1010CFU/kg植物乳杆菌。试验预试期7 d，正试期30 d。

1.3 饲养管理与试验饲粮

参照我国《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制基础饲粮(不含抗生素)。饲粮的常规原料根据猪场实际情况确定，试验用微生物制剂、预混料、抗生素等均由中国农业科学院饲料研究所提供。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(dry matter basis) %

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能

分别于试验始末早饲前以重复为单位空腹称重，用以计算平均日增重。试验期间每天以重复为单位记录饲粮投喂量，每3 d称量1次剩料量，记录饲粮消耗，根据饲粮投喂量和生料量计算平均日采食量。然后根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。

料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.4.2 腹泻率

试验期间，每天观察记录猪的腹泻发生情况。每头猪腹泻1 d记为1个腹泻头次，于试验结束后计算各组的腹泻率。

1.4.3 营养物质消化率测定

采用4 mol/L盐酸不溶灰分(AIA)作为内源指示剂开展消化试验。在试验第31～35天期间的每天上午和下午各收集1次未被垫料污染的粪样，连续收集5 d，每次约收集粪样约200 g，每次收集粪样后放置于冰箱冷冻保存。同时收集部分饲料样品。最后以重复为单位，将每个重复收集的粪样合并为1个样品，经过充分搅拌混匀后，取约500 g作为最终粪样，放置于冰箱冷冻保存。试验结束后，将饲料与粪便样品在65℃烘干至恒重，充分粉碎后，用于分析测定饲料及粪样中的干物质、能量、粗蛋白质、粗脂肪、中性洗涤纤维、粗灰分、钙、磷、AIA的含量。具体方法参照《饲料分析及饲料质量检测技术(第3版)》。

养分的消化率(%)=［1-(饲料中AIA的含量/粪便中AIA的含量)×(粪便中养分的含量/饲料中养分的含量］×100。

1.4.4 直肠粪便微生物数量

采用选择性培养基平板计数法检测直肠粪样微生物菌群数量［13］。于试验最后1天早上称重前从每栏(即每个重复)随机选取1头猪，在无菌条件下用小勺取直肠粪便样品冷藏，并立刻带回实验室进行检测。在无菌操作台内称取1.0 g粪样与9 mL灭菌生理盐水配制成1∶10稀释液(即配制成10-1稀释液)，振荡3～5 min，用微量移液器准确吸取该稀释液1 mL至盛有9 mL灭菌生理盐水试管中，用涡旋振荡器振荡1～2 min，配制成10-2稀释液，依次进行10-3～10-7稀释。将直肠粪样的10-5～10-7稀释液涂布于MRS固体培养基中计数粪样中乳酸菌的数量;10-3～10-5稀释液涂布于麦康凯培养基中计数大肠杆菌的数量。大肠杆菌在37℃有氧培养24 h，乳酸菌在37℃有氧培养36 h。每个稀释梯度重复3次，最后取3次计数的平均值。粪便微生物的数量用lg(CFU/g)(每克粪便中含菌落总数的对数)表示。

1.5 数据处理

生长性能数据采用SAS 9.2统计软件中的PROC GLM程序进行协方差分析，以初始体重为协变量;其他数据采用PROC GLM程序进行单因素随机区组分析。采用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌GF103对生长猪生长性能的影响

植物乳杆菌GF103对生长猪生长性能的影响见表2。各组生长猪的始重差异不显著(P＞0.05)，符合试验要求。各组间生长猪的试验末重、平均日增重、平均日采食量及料重比均有显著差异(P＜0.05)。其中T1组生长猪试验末重显著高于CON和T2组(P＜0.05)，而与PC和T3组差异不显著(P＞0.05);T1组生长猪的平均日增重、平均日采食量均显著高于其他各组(P＜0.05)，而料重比则显著低于其他各组(P＜0.05);T2和T3组生长猪的平均日增重、平均日采食量和料重比与PC和CON组相比均差异不显著(P＞0.05)。各组间生长猪腹泻率无显著差异(P＞0.05)。

2.2 植物乳杆菌 GF103对生长猪营养物质消化率的影响

植物乳杆菌GF103对生长猪营养物质消化率的影响见表3。T1、T3和CON组生长猪的饲粮总能、干物质、有机物质、粗蛋白质、粗脂肪的消化率显著高于PC和T2组(P＜0.05)。T1、T3和 CON组生长猪的饲粮钙的消化率显著高于T2组(P＜0.05)。各组之间的中性洗涤纤维和磷的消化率无显著差异(P＞0.05)。

2.3 植物乳杆菌GF103对生长猪粪便微生物菌群的影响

植物乳杆菌GF103对生长猪粪便微生物菌群的影响见表4。PC与CON组生长猪粪便乳酸菌数量无显著差异(P＞0.05)。添加植物乳杆菌GF103的T1、T2和T3组生长猪粪便中乳酸菌数量显著高于PC与CON组(P＜0.05)，并且粪便乳酸菌数量随着植物乳杆菌GF103添加剂量的增加而增加，T3组生长猪粪便乳酸菌数量显著高于T1和T2组(P＜0.05)。各组生长猪粪便大肠杆菌数量无显著差异(P＞0.05)，但 CON组在数值上高于PC组。T1组生长猪乳酸菌/大肠杆菌显著高于其他各组(P＜0.05)。

表2 植物乳杆菌GF103对生长猪生长性能的影响Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum GF103 on growth performance of growing pigs

表3 植物乳杆菌GF103对生长猪营养物质消化率的影响Table 3 Effects of Lactobacillus plantarum GF103 on the nutritient digestibility of growing pigs %

表4 植物乳杆菌GF103对生长猪粪便微生物菌群的影响Table 4 Effects of Lactobacillus plantarum GF103 on fecal microbiota of growing pigs lg(CFU/g)

3 讨论

植物乳杆菌属于乳酸菌的一种。研究表明在仔猪饲粮中单独补充乳酸菌［1-4］或补充乳酸菌与其他益生菌的复合物［5］均能够显著改善仔猪的生长性能。索成［1］、Lee 等［2］还指出，植物乳杆菌具有替代饲料中抗生素促生长剂并提高仔猪生长性能和健康水平的潜力，尤其是在仔猪肠道处于炎症感染的状态时。这也说明菌群平衡对于动物保持肠道健康和发挥生产性能潜力的重要性［14］。植物乳杆菌GF103为本实验室筛选获得的一株乳酸菌，前期研究表明植物乳杆菌GF103具备益生菌特性［12］。为了研究该菌株在动物肠道中的增殖及其对动物肠道微生物菌群的作用效果，董晓丽等［11］通过在断奶仔猪饲粮中添加植物乳杆菌GF103和芽孢杆菌的复合菌制剂，发现其能降低断奶仔猪粪便中大肠杆菌的数量，增强断奶仔猪免疫力。周盟等［10］在断奶仔猪饲粮中添加植物乳杆菌GF103，分析其降低了断奶仔猪料重比。本试验在饲粮中添加植物乳杆菌GF103对生长猪平均日增重、平均日采食量及料重比均有显著影响，其中以添加1×109CFU/kg植物乳杆菌组的生长猪生长速度最快，并且料重比最低，表明在饲粮中补充益生菌对生长猪的生长和健康有益，同时也说明饲喂植物乳杆菌GF103可以替代抗生素促生长剂达到促生长的目的。前人对乳酸菌的研究也有类似结果，如Chen等［6-7］在生长猪饲粮中粪便添加嗜酸乳杆菌和芽孢杆菌的复合物，显著提高了生长猪的平均日增重。然而张董燕等［8］的研究表明，在生长猪饲粮中添加猪源唾液乳杆菌有提高生长猪平均日增重的趋势但差异不显著。这些研究结果的差异可能与猪的日龄和菌种的组合等因素有关。本试验中各组生长猪腹泻率无显著差异，可能与生长猪的消化、免疫系统相对成熟，保持肠道微生态平衡的能力较高有关［15］。

另外，一定数量的乳酸杆菌是其呈现对宿主有效性的重要因素，如Yu等［16］报道断奶仔猪饲粮中添加5.8×107CFU/g发酵乳杆菌时足够呈现最佳效果，过高或过低都不能获得最佳效果。在多数研究报道中，益生菌添加的剂量是109CFU/g，这个剂量相当于成年猪肠道10～100 g的食糜中含有的益生菌数量［17-19］。De Champs等［20］也报道当平均日采食量达到109～1010CFU时，乳酸杆菌才能够在猪的肠道存活。在欧洲，饲料添加剂要求总活菌数应含有1010CFU/g，预混剂应含有108CFU/g，配合饲料、粉料及颗粒料等全价饲料含有106CFU/g［21］。本试验选择了3个植物乳杆菌 GF103 的剂量浓度(1×109、5×109、1×1010CFU/kg)，结果表明，添加109CFU/kg的植物乳杆菌GF103对生长猪生长性能的作用效果最好，与前人研究结果相符。本试验中生长猪生长性能并没有表现出前人报道的植物乳杆菌［2］和双歧杆菌［17］在断奶仔猪日粮中所呈现的剂量效应，但与Wang等［22］的研究结果类似，该研究在生长猪饲粮中添加芽孢杆菌复合物，随着添加剂量的增加，生长猪料重比与芽孢杆菌剂量之间没有线性关系。这种试验结果的不同可能与多个因素有关，除了生猪的日龄不同以外，还可能与添加剂量、饲粮组成及饲养管理环境等因素有关［9］。

Davis等［23］认为，在饲粮中添加可直接饲喂的微生物(direct-feed microbials，DFM)，如乳酸菌，能够直接改变动物消化道内的菌群组成。乳酸菌能够通过产酸降低肠道pH，促进蛋白酶等消化酶的分泌，从而有益于机体对营养物质的消化吸收，进而促进机体生长［5］。本试验中 T1、T3和CON组总能、干物质、有机物质、粗蛋白质、粗脂肪、钙的消化率显著高于PC和T2组，各组间中性洗涤纤维和磷的消化率无显著差异。本试验与前人研究结果相似［24］。如张董燕等［25］在基础饲粮中添加0.20%、0.40%猪源唾液乳杆菌冻干制剂，可显著提高生长猪氮表观消化率。张常明等［26］在阉公猪饲粮中添加30 mL植物源乳酸菌后发现，植物源乳酸菌组可以提高仔猪物质、粗蛋白质、能量、粗脂肪、钙、磷表观消化率，分别提高 4.22%、6.12%、4.13% 、3.72%、2.86% 、14.78% ，其中干物质、粗蛋白质、能量指标统计检验差异显著。王志祥等［27］向饲粮中添加乳酸杆菌可提高仔猪对饲粮中粗脂肪的表观消化率，并且对仔猪提高饲粮粗蛋白质、钙和总磷的表观消化率也有一定作用。周盟等［10］在断奶仔猪饲粮中添加植物乳杆菌，对仔猪饲粮营养物质效率有一定的改善作用。但是也有研究发现添加益生菌对生长猪营养物质消化率没有显著影响。如Chen等［6］在生长猪饲粮中添加复合益生菌(枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及嗜酸乳杆菌)，对于育肥猪干物质、氮的消化率均没有显著影响，表明干物质、氮的消化率不受饲粮添加益生菌的影响。相似的，Kornegay等［28］在育肥猪饲粮中添加2种益生菌产品(Biomate2B ，包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌;Pelletmate Livestock，包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)也没发现对营养物质(干物质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分和氮)消化率有显著影响。Shon等［29］在饲粮中添加以罗伊氏乳杆菌为主的益生菌(罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母)对生长猪和育肥猪干物质消化率也没有显著影响。Xuan等［30］在饲粮中添加复合益生菌(芽孢杆菌和酿酒酵母)对仔猪营养物质消化率没有显著影响。Stavric等［31］指出在动物肠道微生物区系发育过程中或微生态平衡被破坏时添加益生菌的效果最有效，他们还指出在优良的饲养管理环境下益生菌对于改善生长性能的效果更不明显。因此，不用研究结果的出现可能与猪本身肠道微生态平衡及健康状态有关，乳酸菌对生长猪饲料利用效率的作用效果及其机制需要进一步研究确定。

乳酸菌和大肠杆菌被认为是指示肠道健康的主要菌群［32］，其数量比值被认为是评价动物消化道微生态平衡的重要标志，乳酸菌数量高于大肠杆菌数量能够促进有益菌对肠道病原菌抑制作用的发挥［33］。乳酸菌抑菌的主要原因是其产生的有机酸使回肠、结肠中乳酸、乙酸含量升高，降低肠道pH，而大肠杆菌在pH低于5.5时难以生长［13］。如张董燕等［8］在饲粮中添加 0.2%、0.4%的猪源唾液乳杆菌能够显著增加生长猪粪中乳酸菌数量，显著降低大肠杆菌数量，并显著提高乳酸菌与大肠杆菌的比值;索成［1］给断奶仔猪饲喂植物乳杆菌ZF316后，发现增加了仔猪消化道中有益菌乳酸菌数量，降低了大肠杆菌数量，且提高了两者的比例。本试验饲粮中添加1×109CFU/kg的植物乳杆菌GF103提高了粪便乳酸菌的数量及乳酸菌/大肠杆菌，并有降低粪便大肠杆菌数量的趋势，表明该添加剂量的植物乳杆菌可以刺激生长猪肠道乳酸菌的生长，抑制肠道有害菌增殖。结合本试验生长性能和营养物质消化率的试验结果，综合说明在生长猪饲粮中添加1×109CFU/kg的植物乳杆菌GF103有助于改善生长猪肠道健康和生长性能。

4 结论

①在生长猪饲粮中添加植物乳杆菌GF103，能够改善生长猪肠道菌群环境，提高生长猪生长速度和饲料利用效率。

②本试验条件下，生长猪饲粮中植物乳杆菌GF103适宜添加剂量为1×109CFU/kg。

致谢:

感谢大兴区动物卫生监督管理局穆立田、北京强民猪场厂长陈玉忠及其员工对本试验顺利开展给予的大力支持，感谢本单位陶莲博士在试验样品测定方面给予的帮助。

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