田如男，何 宁，徐 宁，霍明霞

(南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210037)

棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察

田如男，何 宁，徐 宁，霍明霞

(南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210037)

以棱角山矾叶片为外植体进行愈伤组织的诱导与增殖研究，并利用扫描电镜和透射电镜对愈伤组织进行细胞形态学观察。研究结果表明：叶基和叶中是棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最佳部位，且宜选择远轴面向上的接种方式。棱角山矾叶片表面灭菌最适方法为70%酒精灭菌30～90 s，再用2%次氯酸钠灭菌3 min。愈伤组织诱导的最适培养基为B5+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，该培养基上诱导率达到最高，为91.11%。愈伤组织增殖的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，该培养基上愈伤组织的增殖系数达到最高，为1.12，褐变率为14.29%。棱角山矾愈伤组织最佳的继代周期为20 d，以继代1～3次为宜。光暗交替有利于棱角山矾叶片愈伤组织的诱导，而暗培养促进愈伤组织的增殖。5 g/L活性炭对防止棱角山矾叶片愈伤组织褐化的效果最佳。胚性愈伤组织细胞呈球形、大小均一，多以细胞团形式存在，内容物丰富；非胚性愈伤组织细胞形状不规则，内含一大液泡，细胞器较少。

棱角山矾；叶片；愈伤组织诱导；愈伤组织增殖；细胞形态学观察

棱角山矾Symplocos tetragona为山矾科山矾属常绿乔木，主要分布于我国江西、湖南、福建及浙江等省海拔1 000 m以下杂木林中[1]。树冠呈圆锥状或卵圆形，外形优美；叶片油绿有光泽；3～4月开花，花白色，有淡淡的清香，白色的花布满整个树冠，景致优美；枝叶茂密，有隔音功效，对大气有毒成分有较强抗性，是有前途的观赏生态环保型树种[2]。棱角山矾种子有隔年(2 a)甚至3 a发芽特性，属综合深休眠型种子，既存在着种壳导致的强迫休眠，又存在着生理休眠[3]，这严重影响了其有性繁殖进程。目前，对棱角山矾繁殖技术的研究主要集中在扦插繁殖[4]；组培快繁方面的研究较少，仅以种子为外植体进行了初步研究[5]，但至今尚未建立棱角山矾组培快繁的完整体系。本研究以棱角山矾的叶片为外植体，从消毒剂配方、培养基种类、植物生长调节剂配方、接种部位及接种方向、继代周期及继代次数等方面，对棱角山矾叶片愈伤组织的诱导和增殖进行研究，筛选出愈伤组织诱导与增殖的最优方案，为棱角山矾由愈伤组织诱导体胚发生途径再生植株提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采自南京林业大学园林国家级实验教学示范中心的棱角山矾3年生实生苗，在生长健壮的植株上采集新梢嫩叶作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体最佳灭菌方法的选择

将采集的叶片放在洗洁精水中浸泡10 min，不断搅动，用软刷刷洗叶片表面，然后放在流水下冲洗1 h。预处理之后，将叶片置于超净工作台上，用70%的酒精表面杀菌30、60、90 s，然后用无菌水冲洗2～3次，再分别转入2%的次氯酸钠（NaClO）中消毒1、3、5、7、10 min，倒掉消毒液，最后用无菌水冲洗3～4次。将消毒后的叶片在培养皿中切成0.5 cm×0.5 cm左右的正方形，接种到添加0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA的B5培养基上，pH值调至5.8。每处理接种20瓶，每瓶3个外植体，重复3次。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx左右，光照时数14 h/d。25 d后统计污染率、死亡率、成活率。

1.2.2 愈伤组织的诱导

1.2.2.1 基本培养基的筛选

将叶片切成0.5 cm×0.5 cm左右的正方形，分别接种到添加了0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA的MS、WPM、B53种不同的基本培养基上。每处理接种20瓶，每瓶3个叶片，重复3次。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx 左右，光照时数14 h/d。30 d后统计愈伤组织的诱导率以及生长状况。

1.2.2.2 植物生长调节剂的配方

根据上述实验结果，在最适培养基上，采用三因素三水平正交试验进行植物生长调节剂配方的筛选，每处理接种20瓶，每瓶3个叶片，重复3次。正交试验设计方案见表1。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx 左右，光照时数14 h/d。30 d后统计出愈伤组织的诱导率以及生长状况。

表1 6-BA、2,4-D、NAA正交试验设计(L9(34))Table 1 Orthogonal design program of 6-BA, 2, 4-D and NAA (L9(34))

1.2.2.3 接种部位及接种方向对叶片愈伤组织诱导的影响

沿垂直主叶脉方向将叶片横切两刀，将其分为叶尖、叶中、叶基三部分，分别置于最适培养基上培养，每处理接种20 瓶，每瓶3个叶片，重复3 次。30 d后统计愈伤组织的诱导率以及生长状况。

将叶片分别以远轴面向上和近轴面向上置于最适培养基上培养，每处理接种20瓶，每瓶3个叶片，重复3次。30天后统计出愈伤组织的诱导率以及生长状况。

培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx左右，光照时数14 h/d。

1.2.2.4 光照和黑暗对叶片愈伤组织诱导的影响

将棱角山矾叶片接种到最适培养基上，分别进行光暗交替培养和暗培养，每处理接种20瓶，每瓶3个叶片，重复3次。30 d后统计出愈伤组织的诱导率以及生长状况。

光暗交替培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx左右，光照时数14 h/d。

暗培养条件：温度25±1 ℃的暗培养箱。

1.2.2.5 蔗糖浓度对叶片愈伤组织诱导的影响

将叶片接种于蔗糖含量分别为15、30、60、100 g/L 的最适培养基上。每处理接种20瓶，每瓶3个叶片，重复3 次。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx左右，光照时数14 h/d。30 d后统计出愈伤组织的诱导率以及生长状况。

1.2.3 愈伤组织的增殖

1.2.3.1 基本培养基的筛选

将初代培养获得的生长状况良好的愈伤组织切成0.5 cm直径的小块，分别接种到添加0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的MS、WPM、B53种不同的基本培养基上。每处理接种20瓶，每瓶3块愈伤组织，重复3次。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx 左右，光照时数14 h/d。20 d后统计愈伤组织的增殖系数、褐化率以及愈伤组织生长状况。

1.2.3.2 植物生长调节剂的配方

采用三因素三水平正交试验，在最适增殖培养基上进行愈伤组织的增殖培养，每处理接种20瓶，每瓶3块愈伤组织，重复3次。正交试验设计方案同表1。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx 左右，光照时数14 h/d。20 d后统计愈伤组织的增殖系数、褐化率以及生长状况。

1.2.3.3 继代周期及继代次数对愈伤组织增殖的影响

将诱导出的生长状况良好的的愈伤组织接种于最适增殖培养基上，每隔10、15、20、25、30、40 d转接一次。每处理接种20瓶，每瓶3块愈伤组织，重复3次。统计不同继代周期的增殖系数及褐化率。在相同的继代周期下，对诱导出的生长状况良好的愈伤组织连续继代5次，每处理接种20瓶，每瓶3块愈伤组织，重复3次。统计每次继代的增殖系数及褐化率。

培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx左右，光照时数14 h/d。

1.2.3.4 暗培养天数对愈伤组织增殖的影响

将诱导出的生长状况良好的的愈伤组织接种于最适增殖培养基上，暗培养天数分别为5、10、15、20 d，每处理接种20瓶，每瓶3块愈伤组织，重复3次。以光暗交替培养为对照。20 d后统计出愈伤组织的增殖系数、褐化率以及生长状况。暗培养条件：温度25±1 ℃的暗培养箱。光暗交替培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx左右，光照时数14 h/d。

1.2.3.5 蔗糖浓度对愈伤组织增殖的影响

将诱导出的生长状况良好的愈伤组织接种于蔗糖含量分别为15、20、25、30、35、40、50 g/L的最适增殖培养基上。每处理接种20瓶，每瓶3块愈伤组织，重复3次。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx 左右，光照时数14 h/d。20 d后统计愈伤组织的增殖系数、褐化率以及生长状况。

1.2.4 褐化的抑制

在组织培养过程中，褐化是个很难克服的问题，本试验中棱角山矾愈伤组织极其容易发生褐化。试验通过添加维生素C（VC）、活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）来减少愈伤组织褐化现象的发生。试验设计见表2。培养条件：温度25±1 ℃，光照强度3 000 lx 左右，光照时数14 h/d。20 d后统计愈伤组织的褐化率。

表2 防褐化的试验设计Table 2 Test design for prevent browning disease

1.3 数据统计与分析

污染率（%）=接种外植体污染数/接种外植体总数；

死亡率（%）=接种外植体死亡数/接种外植体总数；

成活率（%）=接种外植体成活数/接种外植体总数；

愈伤组织诱导率(%)=产生愈伤组织的外植体数/成活的外植体数；

增殖系数=（继代后愈伤组织重量-继代前愈伤组织重量）/继代前愈伤组织重量。

实验数据用Microsoft Excel 2003和SPSS 13.0统计软件进行计算和方差分析，在方差分析显著的基础上，用Duncan法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 外植体的灭菌处理

经方差分析可知，不同时间的70%酒精灭菌对叶片成活率的影响差异不显著（P＞0.05），而不同时间的2% NaClO灭菌对叶片成活率的影响差异极显著（P＜0.01）。

由表3可以看出，随着2% NaClO灭菌时间的延长，叶片的污染率呈下降趋势，灭菌1 min时污染率最高，达63%以上；死亡率呈上升趋势，灭菌10 min时全部死亡；3 min灭菌时成活率最高，达77%以上。因此，棱角山矾叶片表面灭菌适宜的方法是：用70%酒精灭菌30～90 s，无菌水冲洗2～3次，再用2% NaClO灭菌3 min，无菌水冲洗3～4次。

2.2 愈伤组织的诱导

2.2.1 不同基本培养基对叶片愈伤组织诱导的影响

3种基本培养基对棱角山矾叶片愈伤组织诱导的影响差异显著（P＜0.05）。B5基本培养基对棱角山矾叶片愈伤组织诱导的效果最好，诱导率达84.44%，褐化率仅4.44%，愈伤组织呈黄绿色、疏松、颗粒状，长势良好，为棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最适培养基（见表4、图1）。

表3 不同灭菌处理对叶片灭菌效果的影响†Table 3 Effects of different sterilization treatments on tested leaves

表4 不同基本培养基对叶片愈伤诱导的影响†Table 4 Effects of different basic media on callus induction of tested leaves

图1 不同基本培养基对叶片愈伤诱导的影响Fig.1 Effects of different basic media on callus induction of tested leaves

2.2.2 不同配方植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

由方差分析可知，6-BA质量浓度对棱角山矾叶片愈伤组织诱导率的影响差异不显著（P＞0.05），2,4-D质量浓度影响显著（P＜0.05），NAA浓度影响极显著（P＜0.01）。多重比较（见表5）显示，低质量浓度的2,4-D诱导棱角山矾叶片愈伤组织的效果较好，水平1、2之间差异不显著；NAA质量对愈伤组织诱导的影响较2,4-D大，随着NAA浓度的升高愈伤组织的诱导率呈上升的变化趋势，水平3（即1.0 mg/L）的愈伤组织诱导率最高，达到90.86%。

表5 2,4-D、NAA对愈伤组织诱导影响的多重比较Table 5 Multiple comparisons of 2,4-D and NAA to callus induction

表6显示，7号、5号处理愈伤组织的诱导率最高，分别为93.48%、91.11%；但在7号处理中愈伤组织较致密，且生长慢，易褐化，而5号处理中愈伤组织呈黄色、疏松、颗粒状，且长势旺盛。

综合愈伤组织的诱导率、生长状况、方差分析及多重比较分析结果，得出棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最佳植物生长调节剂配方为5号处理，即：0.5 mg/L 6-BA、0.3 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L NAA。

表6 6-BA、2,4-D和NAA对愈伤组织诱导的影响Table 6 Effects of 6-BA, 2,4-D and NAA on callus induction

2.2.3 接种部位及接种方向对叶片愈伤组织诱导的影响

同一叶片的不同部位诱导愈伤组织的能力不同，叶基和叶中诱导愈伤组织的能力较叶尖强，诱导率达86%以上。从愈伤组织生长状况和生长势来看，叶基和叶中形成的愈伤组织呈淡黄色、疏松、颗粒状，长势旺盛，而叶尖形成的愈伤组织多呈淡褐色，较致密，生长势差（见表7）。因此叶基和叶中是棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最佳部位。

表7 接种部位对愈伤组织诱导的影响Table 7 Effects of inoculation parts on callus induction rate

叶片接种方向对愈伤组织的诱导也有着很大的影响。在相同的培养基和培养条件下，远轴面向上接种的叶片诱导率在88%以上，而近轴面向上接种的叶片，诱导率仅为30%左右。因此接种叶片时均选择远轴面向上的接种方式。

2.2.4 光照和黑暗对叶片愈伤组织诱导的影响

根据上述实验结果，将叶片接种于愈伤组织诱导的最适培养基（添加0.5 mg/L 6-BA、0.3 mg/L 2,4-D、1.0 mg/L NAA的B5培养基）上，分别进行光暗交替培养和暗培养。光暗交替培养和暗培养对棱角山矾叶片愈伤组织诱导的影响极显著（P＜0.01），光暗交替培养更有利于棱角山矾叶片愈伤组织的诱导，暗培养抑制了愈伤组织的诱导（见表8）。

表8 光暗交替培养和暗培养对叶片愈伤组织诱导的影响Table 8 Effects of light and dark on callus induction rate

2.2.5 蔗糖浓度对叶片愈伤组织诱导的影响

不同浓度的蔗糖对叶片愈伤组织诱导的影响极显著，随着蔗糖浓度的升高，愈伤组织诱导率呈先上升后下降的变化趋势，高浓度的蔗糖对叶片愈伤组织的诱导有抑制作用。诱导棱角山矾叶片愈伤组织最佳的蔗糖浓度为30 g/L（见表9）。

表9 蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响Table 9 Effects of sucrose concentration on callus induction rate

2.3 愈伤组织的增殖

2.3.1 不同基本培养基对愈伤组织增殖的影响

由表10可以看出，MS基本培养基为棱角山矾愈伤组织增殖的最适培养基，其愈伤组织增殖系数最高，达到0.89，显著高于B5和WPM培养基，且愈伤组织褐化率明显低于B5培养基，为15.00%，愈伤组织多呈黄绿色、疏松、颗粒状，生长状况良好，长势最快。

表10 基本培养基对愈伤组织增殖的影响Table 10 Effects of different basic media on callus proliferation

2.3.2 不同配方植物生长调节剂对叶片愈伤组织增殖的影响

由方差分析可知，6-BA质量浓度对棱角山矾叶片愈伤组织增殖系数的影响差异不显著（P＞0.05），2,4-D质量浓度影响显著（P＜0.05），NAA质量浓度影响极显著（P＜0.01）；而6-BA质量浓度对棱角山矾叶片愈伤组织褐变率的影响显著（P＜0.05），2,4-D质量浓度影响极显著（P＜0.01），NAA浓度影响不显著（P＞0.05）。结合增殖系数和褐变率，1、2水平的6-BA、1水平的2,4-D和2水平的NAA对棱枝山矾叶片愈伤组织的增殖效果最好（见表11）。结合表12，对棱枝山矾叶片愈伤组织增殖效果最佳的植物生长调节剂组合为4号处理，即0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L NAA。

表11 植物生长调剂对愈伤组织增殖影响的多重比较Table 11 Multiple comparisons of growth regulator of different levels to callus proliferation

表12 6-BA、2,4-D和NAA对愈伤组织增殖的影响Table 12 Effects of 6-BA, 2,4-D and NAA on callus proliferation

2.3.3 继代周期及继代次数对愈伤组织增殖的影响

2.3.3.1 继代周期对愈伤组织增殖的影响

试验将生长良好的棱角山矾叶片愈伤组织每隔不同的天数接种到前期实验筛选出的最佳增殖培养基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA）上，以此研究适合棱角山矾叶片愈伤组织增殖的最佳继代周期。由表13可以看出，随着继代周期的延长，愈伤组织的增殖系数呈先增大后减小的变化趋势，而褐变率呈不断上升的变化趋势。继代周期为20 d时对愈伤组织的增殖最有利，此时愈伤组织的增殖生长达到最佳状态，与其它继代周期形成显著差异（P＜0.05）。

表13 继代周期对愈伤组织增殖的影响Table 13 Effects of numbers of days of subculture cycle on callus proliferation

2.3.3.2 继代次数对愈伤组织增殖的影响

本试验每一次继代增殖都采用相同的继代培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+ 0.5 mg/L NAA，以研究继代次数对棱角山矾叶片愈伤组织增殖的影响。由表14可以看出，继代1次、2次、3次的愈伤组织增殖系数之间差异不显著（P＞0.05），从第4次继代开始，增殖系数显著下降。愈伤组织的褐化率随继代次数增加呈缓慢上升的变化趋势。在继代过程中，愈伤组织本身的生长状态没有变化，均表现为黄色、疏松、颗粒状（见图2）。因此，较好的继代次数为1～3次，不宜继代过多。

表14 继代次数对愈伤组织增殖的影响Table 14 Effects of subculture times on callus proliferation

2.3.4 暗培养天数对愈伤组织增殖的影响

由表15可以看出，对照（光暗交替培养下）愈伤组织的增殖系数最低，褐变率最高。随着暗培养天数的增加，愈伤组织的增殖系数呈上升趋势，褐化率呈下降趋势，暗培养促进了棱角山矾愈伤组织的增殖。

图2 继代次数对愈伤组织增殖的影响Fig.2 Effects of subculture times on callus proliferation

表15 暗培养天数对愈伤组织增殖的影响Table 15 Effects of numbers of dark culture days on callus proliferation

2.3.5 蔗糖质量浓度对愈伤组织增殖的影响

蔗糖质量浓度对愈伤组织褐化率的影响不显著（P＞0.05），但对愈伤组织增殖系数有显著影响（P＜0.05）。随着蔗糖质量浓度的增加，愈伤组织的增殖系数呈先上升后下降的趋势，棱角山矾愈伤组织增殖最适宜的蔗糖质量浓度为30 g/L，浓度过高或过低均会导致愈伤组织的增殖系数下降（见表16）。

表16 蔗糖质量浓度对愈伤组织增殖的影响Table 16 Effects of sucrose concentrations on callus proliferation

2.4 不同抗褐化剂对褐化的抑制

由表17可以看出，添加AC的培养基中愈伤组织的褐化率显著低于对照和其他处理，对愈伤组织的褐化具有较好的抑制作用。但AC在吸附有毒物质的同时，也会吸附培养基中的激素和营养物质，鉴于不同含量活性炭之间差异不显著，因此认为 5 g/L AC为最佳添加量。添加VC和PVP的培养基中愈伤组织的褐化率较大，与对照差异不显著（P＞0.05），抑制褐化效果较差。

表17 不同抗褐化剂对褐化的抑制作用Table 17 Inhibition effects of different anti browning agents on browning disease

2.5 愈伤组织的细胞形态学观察

从外部形态上看，棱角山矾两种不同类型的愈伤组织在形态、质地和颜色上有明显的区别，胚性愈伤组织质地疏松、黄绿色，呈颗粒状。非胚性愈伤组织质地致密、浅黄色或白色，呈水渍状（见图3）。在扫描电镜（SEM-500Philips）下观察发现，胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的表面结构存在较大的差异。胚性愈伤组织表面细胞饱满，呈规则的颗粒状突起或皱褶结构，细胞大小近乎相等，容易形成多细胞团，组成细胞团的细胞之间结合紧密，而细胞团与细胞团之间结合疏松，中间具有一定的空隙，细胞表面有少量附着物。非胚性愈伤组织表面结构疏松，呈不规则球形排列，每个细胞表面有少量附着物，大都以单个细胞存在（见图4）。

在透射电镜（HITACHI 7650）下观察发现，胚性细胞中央大液泡开始解体，细胞质浓厚，细胞质中含有大量线粒体、内质网、质体，质体中含有体积较大的淀粉粒。非胚性细胞中液泡大，几乎占据整个细胞，液泡中含有少量的高电子质密的嗜鹅物质（脂蛋白类物质），细胞器很少，只有少量的质体、线粒体以及细胞核紧贴细胞壁排列（见图5）。

图3 胚性（左）、非胚性（右）愈伤组织Fig.3 Embryonic callus (left) and non-embryonic callus(right)

图4 胚性（左）、非胚性（右）愈伤组织（扫描电镜）Fig.4 Embryonic callus (left) and non-embryonic callus(right) ( scanning electron microscope)

图5 胚性（左，Bear=2.0 μm）、非胚性（右，Bear=5.0 μm）愈伤组织（透射电镜）Fig.5 Embryonic callus (left, Bear=2.0 μm) and nonembryonic callus (right, Bear=5.0 μm)(transmission electron microscope)

3 结论与讨论

外植体的表面灭菌是植物离体培养的第一个步骤，消毒方法的选择在离体培养中至关重要，应最大限度地杀灭外植体所带的真菌和细菌，而对外植体伤害最小。本试验选用对植物伤害较小的NaClO作为消毒剂。结果表明，用70%酒精灭菌30～90 s、无菌水冲洗2～3次，再用2%NaClO灭菌3 min、无菌水冲洗3～4次，棱角山矾叶片成活率最高，达77%以上。

离体培养的成功与培养基的类型有很大的关系。不同基本培养基中的无机离子、有机营养物质含量各异，因而外植体对培养基的反应也就不同。本试验选用含较高浓度硝酸盐和NH4+的MS培养基、较低浓度硝酸盐和NH4+的WPM培养基以及较高浓度硝酸盐和较低浓度NH4+的 B5培养基进行叶片愈伤组织诱导和增殖，结果得出B5基本培养基为棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最适培养基，而MS基本培养基为棱角山矾愈伤组织增殖的最适培养基。可见不同培养阶段对外界离子的需求不同，棱角山矾愈伤组织增殖培养阶段对NH4+的需求显著增加。

植物生长调节剂的种类、质量浓度及配比是植物愈伤组织诱导成功与否的关键因子。生长调节剂中的细胞分裂素与生长素配比是诱导器官发生的关键因素[6-7]。NAA和2,4-D是愈伤组织诱导中最常用的两种生长素，6-BA是愈伤组织诱导中最常用的细胞分裂素[8]。本试验结果显示，培养基中同时添加6-BA、2,4-D、NAA有利于棱角山矾愈伤组织的诱导与增殖。6-BA质量浓度大小对棱角山矾叶片愈伤组织诱导率和增殖系数的影响不显著（P＞0.05），但高质量浓度的6-BA促使愈伤组织褐变，且使愈伤组织紧密；高质量浓度的NAA有利于棱角山矾叶片愈伤组织的诱导，但Linet al.（2010）[9]认为高质量浓度的NAA抑制楸树愈伤组织的诱导，且使组织褐化；低质量浓度的2,4-D对棱角山矾叶片愈伤组织的诱导和增殖效果较好，高质量浓度的2,4-D会引起组织的褐化。对木本植物愈伤组织增殖研究中发现，采用比愈伤诱导阶段更低的生长素质量浓度更有利于愈伤组织的增殖[10-11]。本试验也得到相同结果，棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最适培养基为B5+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA，增殖培养时降低生长素质量浓度有利于愈伤组织的增殖，其最适增殖培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA。

在组织培养中, 光影响植物愈伤组织的生长发育和生理变化，不同的光因子对不同植物愈伤组织的生长有不同的效应[12-14]。本试验中光暗交替培养时棱角山矾叶片愈伤组织的诱导率高，质地疏松，长势好，与时颂等（2013）[15]对6个切花菊品种在不同光照下愈伤组织诱导的结果一致；暗培养抑制棱角山矾愈伤组织的诱导，但能促进愈伤组织的增殖。目前有关暗培养促进愈伤组织增殖的机理尚不明确，本试验结果显示，暗培养促进愈伤组织增殖的原因之一可能是暗培养减轻了愈伤组织的褐化率。

褐化现象在植物组织培养过程中普遍存在，而褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在。褐化现象产生原因很多，因植物种类、外植体取材季节、生长部位、生理状态以及消毒方式、培养基配方及培养条件等不同而不同。木本植物一般比草本植物更容易发生褐化。本试验研究表明，添加AC的培养基对棱角山矾叶片愈伤组织的褐化具有较好的抑制作用，褐化率显著低于添加VC和PVP的培养基，与杜敬然等（2010）[16]研究结果一致。考虑到AC会吸附培养基中的生长调节物质，对外植体的生长带来竞争性抑制。因此，应结合具体情况适当提高生长调节剂的质量浓度。

棱角山矾的胚性愈伤组织中含有大量的线粒体，中央大液泡开始解体，可见此时胚性细胞处于代谢活跃的状态。同时在质体中含有体积较大的淀粉粒，能为胚性细胞的分化、发育提供能量和营养。棱角山矾胚性愈伤组织中的线粒体、小液泡、淀粉粒、内质网等为胚性细胞的进一步分化和发育奠定了物质基础。

本研究以棱角山矾的叶作为外植体，进行愈伤组织的诱导和增殖研究，可为棱角山矾苗木优良无性快繁体系的建立提供前期基础。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第60卷第2分册[M].北京:科学出版社, 1995.

[2]浙江植物志编辑委员会.浙江植物志：第5卷[M].杭州:浙江科学技术出版社, 1993.

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Induction and cell morphological observation of callus from leaves ofSymplocos tetragona

TIAN Ru-nan, HE Ning, XU Ning, HUO Ming-xia
(College of Landscape Architecture, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

The callus induction and proliferation of leaves ofSymplocos tetragonawere conducted, and the observations of callus cell morphology were carried by using scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. The results show that the best parts of callus induction were in leaf base and leaf midst with method of keeping the leaves’ abaxial face up; The most appropriate method of surface sterilization on leaves was 70% alcohol for 30 to 90 seconds and 2% NaClO for 3 minutes; The optimal callus induction medium of leaves was B5+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+30 g/L sucrose, with a maximum induction rate of 91.11%; The optimal callus proliferation medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+30 g/L Sucrose, with a maximum multiplication factor of 1.12, and the browning rate was 14.29%; The best subculture cycle of callus was 20 days, and the generation of 1～3 times was appropriate. The culture of alternating light and dark was bene fi t to callus induction, however, the proliferation of callus was promoted under dark culture. The best treatment for inhibiting browning was 5g/L acticarbon. The cells of embryonic callus are spherical in uniform size with rich inclusions, forming cell masses; While the cells of non-embryonic callus are irregular, containing a large vacuole, less organelles.

Symplocos tetragona; leaf; callus induction; callus proliferation; cell morphological observation

S722.3+5 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2015)12-0001-09

2014-09-23

国家林业局948项目（2012-4-33）；江苏省林业三项工程（Lxsx[2008]32）；江苏高校品牌专业建设工程资助项目；江苏省高校“青蓝工程”资助项目（2012年）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

田如男，教授，博士生导师；E-mail：beike0607@aliyun.com

田如男，何 宁，徐 宁，等. 棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察[J].中南林业科技大学学报,2015,35(12): 1-9.

[本文编校：文凤鸣]