蔡敏　李长春　毕宏光　唐正宇　方翔

摘要：研究孝感本地生长的荷叶，通过超声波辅助乙醇提取法，获得荷叶黄酮的粗提物，再采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3种不同大孔吸附树脂进行分离纯化，通过静态吸附-解吸试验对3种树脂的纯化工艺进行选择。结果表明，在pH 6.5，温度30 ℃，转速180 r/min的恒温振荡器中，HPD-450的吸附量为95 mg/g、吸附率为39.38%、解吸率为50%，HPD-600的吸附量为98 mg/g、吸附率为40.66%、解吸率为70%，HPD-826的吸附量为112 mg/g、吸附率为46.89%、解吸率为56%。综合考虑HPD-826型大孔树脂对荷叶黄酮纯化效果最佳，适用于精制荷叶黄酮。

关键词：荷叶；黄酮；大孔树脂；纯化

中图分类号：S682.32；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5691-03

Abstract： The lotus leaf of Xiaogan local growth was studied. The total lotus leaf flavonoids were obtained by ethanol ultrasonic assisted extraction. Three different macro porous absorption resin of HPD-450， HPD-600 and HPD-826 were used to separate and purify the flavonoids. Three kinds of resin purification process were optimized by static adsorption-desorption experiment. The result showed that the adsorption quantity of three kinds of resin were 95 mg/g， 98 mg/g， 112 mg/g， the adsorption rate were 39.38%， 40.66%， 46.89% and the desorption rate were 50%， 70%， 56% for HPD-600， HPD-450 and HPD-826 respectively under the conditions of pH 6.5， temperature 30 ℃， thermostatic oscillator in the speed of 180 r/min. The effects of temperature and the pH on dynamic adsorption were discussed. Therefore， macroporous resin of HPD-826 was suitable to refine lotus leaf flavonoids.

Key words： lotus leaf； flavonoids； macroporous absorption resin； extraction and purification

荷叶为睡莲科（Nymphaeaceae）水生植物，资源丰富，主要分布在湖北、湖南、安徽、江西、福建、江苏、山东等省份。荷叶的化学成分十分复杂，至今已从荷叶中分离出生物碱、黄酮类化合物等多种主要化学成分[1，2]。研究表明，荷叶中含有以槲皮素为主要成分的黄酮类物质，且含量丰富[3]。张贇彬等[4]从荷叶中分离出山萘酚和槲皮素-3-丙酯。Elegami等[5]从荷叶中分离出了Myricetin-3-（6-p-coumaroyl）-glucoside，Nympholide A和Nympholide B等黄酮类物质。延玺等[6]通过研究发现黄酮类化合物具有多种生理功能和抵抗疾病的作用。

通过研究孝感本地生长的荷叶，在试验室条件下对荷叶黄酮类粗提物提取工艺研究的基础上，使用大孔吸附树脂HPD-450、HPD-600、HPD-826对荷叶黄酮类粗提物的分离纯化效果优化，采用静态吸附—解吸试验和动态吸附—解吸试验相结合的研究方法，获得静态吸附曲线、吸附率和解吸率，通过比较3种树脂的各种参数，选出适当的树脂对荷叶黄酮进行分离纯化[7，8]。并且在此基础上探讨了pH、乙醇体积分数、恒温振荡器的温度、转速对大孔吸附树脂吸附率和解吸率的影响[9，10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜荷叶分别于7月、8月和9月采集于孝感后湖公园中本土生长的荷叶品种。将采集的荷叶用电热鼓风干燥箱在70 ℃下烘8 h，中草药粉碎机粉碎，用60目筛子重复筛选3次得到荷叶粉末，装袋密封，放置冰箱内，备用[11]。

1.2 试剂与设备

试剂：芦丁标准品（贵州迪大科技有限公司）；大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 均为分析纯。

设备：中草药粉碎机（天津市泰斯特有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；DL-480B型超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；DT5-2型低速台式离心机（北京时代利离心机有限公司）；SHZ-III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；ZHWY-211B型恒温振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；UV-5200型紫外可见分光光度计（上海元析儀器有限公司）；FE20型pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；TBD-2000型中压层析制备系统（SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO.，LTD.）；Φ5.0×40型层析柱（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的制定 称取10 mg芦丁标准品，用30%乙醇标定在50 mL容量瓶中，配成浓度为0.200 mg/mL的芦丁溶液，再分别取0、1、2、3、4、5 mL于25 mL的容量瓶中，在每个容量瓶中加入1 mL 5%的NaNO2振荡6 min后加入l mL 5% Al（NO3）3，振荡5 min，再加入10 mL 10%的NaOH，定容到刻度线，以空白试剂为参比液，于510 nm处测其吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线（图1）。

1.3.2 正交试验设计 以影响荷叶黄酮提取率的乙醇体积分数、料液比（g∶mL，下同）、提取时间和提取温度为4个影响因素，取各自的3个水平进行正交试验，试验的因素与水平见表1。

1.3.3 大孔吸附树脂静态吸附试验 主要采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3种树脂进行静态吸附和解吸试验，3种树脂均为白色不透明球状颗粒，它们的性能指标见表2。用电子天平准确称取已经预处理好的3种树脂各1 g，分别放入3个干净的150 mL的具塞锥形瓶，取荷叶黄酮提取液70 mL于烧杯，再准确量取60%乙醇140 mL加入烧杯，在每个150 mL的锥形瓶中加入稀释后的提取液40 mL（测得pH为6.5），在不改变提取液pH的条件下，放入恒温振荡器中（30 ℃，180 r/min）静态吸附，然后每间隔1 h测定锥形瓶上清液中黄酮的浓度。方法如下：分别用3个移液管，在每个移液管贴上标签，准确量取锥形瓶上清液1 mL于3个25 mL的小烧杯，测定方法同标准曲线。测定得到其吸光度，带入回归方程公式即可得到锥形瓶中上清液黄酮的浓度。

按照下列算式计算出各种树脂的静态吸附量（mg/g）：

上式中，Q是静态吸附量（mg/g）；C是初始浓度（mg/mL）；Cv是剩余浓度（mg/mL）；V是溶液体积（mL）；W是树脂质量（g）。

假设吸附前与后提取液体积无变化，可按下列算式计算出树脂的静态吸附率：

1.3.4 大孔吸附树脂静态解吸试验 待静态吸附达到平衡状态后，取出上述吸附饱和的3种大孔树脂过滤，滤纸吸收树脂表面的残留溶液，然后放回锥形瓶，加入60%乙醇50 mL，置于恒温振荡器中（30 ℃，180 r/min）静态解吸，每隔1 h收集一次上清液测定黄酮的浓度。

2 结果与分析

2.1 荷叶黄酮提取工艺结果

正交试验优化荷叶黄酮试验结果见表3。由表3可知，荷叶中黄酮提取的最佳试验条件为B1A2C1D3，即料液比l∶20，60%乙醇，60 ℃，提取4 h。按照上述获得的荷叶黄酮提取条件，将7、8、9月采集于孝感后湖公园本土生长的荷叶样品分别进行浸提，通过紫外可见分光光度计检测，吸光度代入芦丁标准曲线线性回归方程可得，7、8、9月荷叶样品黄酮含量分别为7.84、7.92、7.87 mg/g，平均含量为7.88 mg/g，此时黄酮得率为0.788%。

2.2 大孔吸附树脂静态吸附结果

3种大孔树脂静态吸附在每个时间段的静态吸附量见表4。运用Excel软件绘制出3种树脂的静态吸附动力学曲线见图2。由表4和图2可知，HPD-826型大孔吸附树脂在6 h左右吸附量就可以达到最大值112 mg/g，而HPD-450和HPD-600需在8 h左右达到饱和吸附量，分别为95、98 mg/g。在相同分离纯化条件下HPD-826型大孔吸附树脂达到平衡的时间相对短，吸附量较大，吸附率较高。

2.3 大孔吸附树脂静态解吸结果

恒温振荡器中30 ℃，180 r/min静态解吸，每隔1 h收集一次上清液测定黄酮的浓度，3种大孔树脂在每个时间段的静态解吸率见表5。运用Excel软件绘出3种树脂的静态解吸率曲线见图3。由表5和图3可知，3种树脂的解吸平衡时间都在6 h左右，HPD-450、HPD-600和HPD-826型大孔吸附树脂的解吸率分别是50%、70%和56%。

3 小结与讨论

本研究首先通过正交优化试验，确定超声波辅助乙醇提取的最佳试验条件为料液比l∶20，60%乙醇，温度60 ℃，提取4 h。将处于生长期的荷叶样品分别进行浸提，通过紫外可见分光光度计检测，7、8、9月荷叶样品黄酮含量分别为7.84、7.92、7.87 mg/g，平均含量为7.88 mg/g，此时黄酮得率为0.788%。

采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3种大孔吸附树脂进行静态吸附-解吸试验，分析吸附量、吸附率和解吸率，结果表明，3种大孔吸附树脂的吸附量和吸附率HPD-826>HPD-600>HPD-450，解吸率HPD-600>HPD-826>HPD-450。综合3种大孔吸附树脂的性能指标，HPD-826的吸附量最高，吸附平衡时间最短，而且解吸率适中，因此选取HPD-826型大孔吸附树脂对荷叶黄酮纯化精制。

对HPD-826型大孔树脂动态吸附-解吸试验过程发现，上清液的pH和温度变化会影响荷叶黄酮与树脂之间的吸附和解吸能力，大孔树脂的吸附性随着pH的增加先变大后减小，随着温度的增加变大。

参考文献：

[1] 杨冀艳，胡 磊，许 杨.荷叶黄酮类化合物的研究进展[J].食品科学，2007，28（8）：554-558.

[2] 许金蓉.荷叶黄酮提取工艺及抗氧性研究[J].轻工科技，2014， 31（10）：15-18.

[3] 赵昕岚，邓放明.荷叶中总黄酮和荷叶碱含量变化规律[J].食品与机械，2013，29（2）：37-40.

[4] 张贇彬，戴妙妙，李彩侠.荷叶中黄酮类化合物的化学结构鉴定[J].食品研究与开发，2006，27（6）：45.

[5] ELEGAMI A A ，BATESC G，GRYAI H，et al. Two very unusual macrocylic flavonoids from water lilynymohaca lotus[J].Phytochemistry，2003，63（6）：731.

[6] 延 玺，刘会青，邹永青，等. 黄酮类化合物生理活性及合成研究进展[J].有机化学，2008，28（9）：1534-1544.

[7] 于智峰， 王 敏.大孔吸附树酯在黄酮类化合物分离中的应用[J].中药材，2006，29（12）：1380-1382.

[8] 刘 云，刘良燚，朱欣婷.D140型大孔树脂纯化荷叶总黄酮的研究[J].安徽农业科学，2009，37（32）：16163-16164.

[9] 黄阿根，董瑞建，韦 红，等.大孔树脂对荷叶黄酮的分离纯化[J].现代食品科技，2008，24（12）：1202-1206.

[10] 张 蕾，李梅香，吴秀玲，等.AB-8樹脂分离纯化荷叶总黄酮的研究[J].食品研究与开发，2014，35（10）：42-45.

[11] 高 丽，王燕龙，熊云景，等.HPD-100大孔树脂分离纯化荷叶黄酮的研究[J].中国酿造，2012，31（8）：127-129.

（责任编辑 龙小玲）