摘要：对努鲁尔虎山脉北麓内蒙古敖汉旗段和河南商丘地区采集大豆[Glycine max （L.） Merr]根瘤进行内生菌的分离纯化，对获得的74株菌株分别进行重金属（Pb2+、Cu2+、Cr6+、Hg2+）抗性测定，对筛选菌株进行生物学特征研究。结果筛选出4株抗性较强的优良菌株，即SQLD42、SQLD47、SQLD67和SQLD71。对重金属的抗性大小表现为：Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.6 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）。筛选的4株菌均来源于努鲁尔山北麓的内蒙古敖汉旗段，其抗逆性与宿主植物大豆的生长环境密切相关。

关键词：大豆[Glycine max （L.） Merr]；根瘤内生菌；重金属抗性；生物学特性；生长环境

中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5569-03

Abstract： Endophytes were isolated from soybean nodules collected from Aohan county of Inner Mongolia in north side regions of Nuluerhu mountain eastern partion and Shangqiu region of Henan for purification. Obtained 74 isolates were tested by heavy metal resistance， and screened strains were performed by biological characteristics study. The results showed that 4 strains with stronger resistance， SQLD42、SQLD47、SQLD67 and SQLD71. Heavy metal resistance was shown as： Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.6 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）. Screened 4 isolates from Aohan county of Inner Mongolia， their resistance were closely related to growing environment of host plant soybean.

Key words： soybean[Glycine max（L.） Merr]； nodule endophytes； heavy metal resistance； biological characteristics； growing environment

在根瘤菌与豆科植物共生关系过程中，根瘤中定殖着不同内生菌，根瘤内生菌对宿主植物具有广泛的生物学作用，如促生、防病、内生联合固氮等[1]。内生菌通过产生次生代谢物质，如抗生素、水解酶类和促生物质等与病原菌竞争作用来防治植物病害有较好的应用前景[2]。近些年，对植物内生菌研究范围在逐渐扩大，从不同植物豆科植物中分离内生菌，研究其生物学特性及与宿主之间的关系等[3，4]，但目前对大豆[Glycine max （L.） Merr]根瘤内生菌重金属抗性的研究鲜见报道，本研究通过对比采样地努鲁尔山内蒙古敖汉旗段与河南省商丘市的大豆根瘤内生菌的重金属抗性，探索地理环境对大豆根瘤内生菌抗性的影响，为收集微生物新资源和开发抗性菌株提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离纯化

对从河南商丘地区与内蒙古敖汉旗地区采集的大豆根瘤进行分离，首先用无菌水对根瘤进行清洗，用体积分数为95%的乙醇处理20～30 s，后用3%NaClO对其处理3～5 min，再用无菌水漂洗6～8次，然后压迫根瘤并在YMA培养基上划线接种，在培养5～7 d后，经划线分离后得到纯的单菌落，最后接种到YMA斜面上，28 ℃培养3～5 d，4 ℃低温保藏，总计获得74株菌株。

1.2 试剂和培养基

重金属盐和螯合剂：K2CrO4、CuSO4·5H2O、HgCl2、Pb（NO3）2、NiCl2、EDTA。

YMA培养基[5]：酵母粉3 g，甘露醇10 g，琼脂粉18 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，水1 000 mL，pH 6.8～7.0。

TY液体培养基[5]：胰蛋白胨5 g，酵母粉3 g，CaCl2·2H2O 0.7 g，pH 6.8～7.2，H2O 1 000 mL。

1.3 抗性测定

1.3.1 菌悬液的制备 首先用移液器注射1.5 mL蒸馏水于2 mL离心管中，取出接种培养饱满菌苔的斜面，刮取适量菌苔于离心管中并振荡均匀，8 000 r/min离心10 min，弃上清，再加入1.5 mL蒸馏水，继续重复上述操作一次，制成OD≈1（108 CFU/mL）的菌悬液，备用。

1.3.2 接种 每次吸取0.3 mL菌悬液加入多孔接种器槽内，根据对同一株菌的不同浓度梯度处理，配制多个平板，每次在一个平板内点接20个菌样，28 ℃培养3～5 d，观察结果。

1.3.3 重金屬抗性测定 将YMA培养基与铜、铅、汞、铬重金属母液分别湿热灭菌，灭菌后混合均匀，加入0.5 mmol/L EDTA，使Cu2+最终浓度为0.15、0.50、0.90、1.20、1.60和1.80 mmol/L；Hg2+最终浓度为0.025、0.05、0.075和0.100 mmol/L；Pb2+最终浓度为2、3、4、5和6 mmol/L；Cr6+最终浓度为0.3、0.6、0.9、1.2和1.4 mmol/L；以不添加重金属的YMA培养基为对照，接种后置于28 ℃恒温培养，3～5 d后观察生长状况。

1.4 生物学特征

按照微生物基本试验方法[5]，进行菌株菌落特征、细胞学特征和液体培养特征观察等。

2 结果与分析

2.1 重金属抗性

由表1可知，Cu2+浓度为0.15 mmol/L时所有菌株均生长很好，Cu2+浓度为0.50和0.90 mmol/L时，除菌株SQ12LD61和SQ12LD68存活外，其他菌株生长良好或很好，在Cu2+浓度为1.20和1.60 mmol/L时，SQ12LD61和SQ12LD68生长受到抑制，其他菌株存活；当Cu2+浓度为1.8 mmol/L时所有菌株均不生长。

由表2可知，所有菌株在Hg2+浓度为0.025 mmol/L时均能很好生长，在Hg2+浓度为0.050 mmol/L的培养基上菌株SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71都生长很好，其余菌株不同程度地受到影响；而在Hg2+浓度为0.075 mmol/L时这4株菌株存活，此浓度为最大抗性浓度。

由表3可知，所有菌株在Cr6+浓度为0.3和0.6 mmol/L的培养基上均生长很好或良好；在Cr6+浓度为1.2 mmol/L时有4株菌株（SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71）能够存活，其他菌株生长均受抑制，此浓度为抗性最大浓度。

由表4可知，在Pb2+浓度为2、3、4 mmol/L梯度下菌株均能生长很好或良好；而Pb2+浓度为5 mmol/L时为菌株抗性的最大浓度，SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71仍存活。重金属抗性结果分析可知，在设定重金属浓度的培养基上，大豆根瘤内生菌对重金属的最大抗性表现为Pb2+（5 mmol/L）>Cu2+（1.60 mmol/L）> Cr6+（1.2 mmol/L）>Hg2+（0.075 mmol/L）。另外，重金属低浓度下对菌株没有影响反而促进微生物的生长，高浓度下抑制菌体的正常生长，在一定浓度范围内重金属浓度和菌体生长趋势呈负相关。

2.2 筛选菌株的生物学特性

根据对重金属抗性结果，筛选出4株抗性较强的菌株，即SQ12LD42、SQ12LD47、SQ12LD67和SQ12LD71。经固体平板培养、液体培养，测量菌体大小等，生物学特征如表5。由表5可知，4株菌株的平板菌落特征均为湿润、（半）透明、液体培养均产生絮状沉淀并产生气泡，革兰氏染色SQ12LD42呈紫色，为革兰氏阳性菌，其余3株为革兰氏阴性菌。根据以上特征和依据《细菌分类手册》与《伯杰氏细菌手册》，初步判定4株菌株均为豆科植物根瘤内生细菌特征。

3 小结

筛选的4株菌均来源于努鲁尔山北麓的内蒙古敖汉旗段，对重金属均表现出较强抗性，这些抗性与采集地大豆的生长环境密切相关。内蒙古敖汉旗地下蕴藏着丰富的矿产资源，如铁、金、铜、钨、铅、石灰石等，长期的自然选择筛选出抗性强的菌株。而商丘市地处豫东平原，属黄淮流域，地势平坦，土壤多为沙壤土，除人为工业重金属污染外没有天然的重金属污染矿区。徐亚军等[6]研究表明，根瘤菌与豆科植物形成共生固氮体系，它的地理分布受到地形、土壤结构、气候及宿主植物分布等影响。而内生菌和根瘤菌共处于根瘤微环境，它们与宿主植物形成了稳定的互惠互利关系，共同抵御外界不良环境的胁迫，提高了内生菌的抗逆性，可能也是内生菌抗重金属的一个原因。

本试验通过平板富集、群体效应进行，结果表明，菌株对不同重金属浓度的抗性不同，低浓度促进菌体的生长，高浓度抑制菌体的生长。由于在低浓度下，这些重金属离子是微生物生长所需的营养要素，如生物体中的某些酶是以Cu作为辅基，Cr与细胞膜稳定性、核酸结构以及生物体的正常代谢有关[7]。筛选出的4株菌能够同时耐受多种重金属，可能是通过分泌质子氨基酸以及各种有机酸，提高体系的酸度，溶解重金属，或者利用代谢产物与重金属配合改变形态[8]。有研究表明，快生型大豆根瘤菌在代謝过程中能分泌有机酸和各种氨基酸等代谢产物。

由于重金属毒害使敏感菌丧失而耐受菌富集[9]，这使得微生物群落对环境胁迫的适应能力增强[10]。本试验74株菌中，菌株对Pb2+的最大抗性浓度为5 mmol/L，对Cu2+的最大抗性浓度为1.60 mmol/L；对Hg2+的抗性最小，浓度为0.075 mmol/L。可见，菌株对不同重金属间的抗性存在差异。抗性差异除了与菌株本身遗传因素有关外，还与寄主植物的生态条件密切相关。这可能是由于根瘤内生菌与相应寄主植物对特殊环境长期相适应的结果[11]。缪福俊等[12]对会泽铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌耐铅锌研究结果，王金华等[13]对兰坪铅锌尾矿区植物根瘤菌对重金属等因子的抗性研究，均支持了本研究结果。但对于每种重金属的具体抗性机制以及抗性菌株的系统发育地位正在进一步的研究。

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（责任编辑 韩 雪）