张曈 刘晓燕 许家兴 李登超 羊燕燕

（江苏省生物质能与酶技术重点实验室 江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心 淮阴师范学院 江苏淮安 223300）

黑曲霉产纤维素酶发酵条件的优化及酶学性质研究

张曈 刘晓燕 许家兴 李登超 羊燕燕

（江苏省生物质能与酶技术重点实验室 江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心 淮阴师范学院 江苏淮安 223300）

本文用单因素实验和响应面法对黑曲霉B3菌株产纤维素酶培养条件进行了优化，确定了黑曲霉B3产纤维素酶的最优条件：小麦秸秆2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，发酵时间73.08h，接种量为8.004%，150 r/m in振荡培养，此条件下黑曲霉B3发酵液的FPA酶活力为153.4 U/m L。将粗酶液初步纯化后，对纯化纤维素酶的酶学性质进行了初步研究，确定了其最适温度为60℃，最适pH值为6.0，Ca2+、Li+、K+等金属离子对其有激活作用，苯甲基磺酰氟（PMSF）对该酶强烈抑制，该酶对底物CMC的Km值和Vmax分别是24.0mg/m L和0.09mg/min。

黑曲霉；纤维素酶；液体发酵；优化；响应面法

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一种复合酶,主要包括内切葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。利用纤维素酶可开发丰富的纤维素资源,纤维素酶在生物质能源、秸秆综合利用、可再生资源、食品、饲料、酿造等领域都有广泛的应用前景[1～3]。然而，就目前而言，纤维素资源的利用率低，同时还会对环境会造成一定污染。因此，如何成功的开发这一资源，对解决人类面临的能源问题、环境问题、可持续发展都具有非常重要的意义[4]。

通过纤维素酶降解纤维素的研究和应用进展快速，商业化程度较高[5]。纤维素酶的工业化生产可分为固体发酵法和液体深层发酵法，液体深层发酵法的培养条件不易污染杂菌，容易控制，生产效率也较高，被国内外重要的研究和生产工艺广泛应用[6-7]。黑曲霉作为一种自然界中常见的丝状真菌，是公认安全的真核微生物。用其生产酶制剂安全、高效、无毒素产生，而且黑曲霉生长期短，产酶速度快，生产的纤维素酶主要分泌到细胞外，便与纯化[8]。发酵条件的优化是当前增加纤维素酶活力、提高产酶量的主要途径之一[9]。对发酵条件进行优化一般采用单因素优化和正交实验优化，但它们都有一定的局限性，无法直接找到区域中各个因素的最佳组合和响应值的最优值[10]。借助design expert统计软件能迅速、可靠、简易地进行优化试验的安排和数据分析，从而找出微生物培养条件的最佳组成[11]。本文利用design expert8.06软件对黑曲霉产纤维素酶的液体发酵条件进行优化，并将最优条件下生产得到的纤维素酶进行初步纯化，研究其酶学性质，为黑曲霉大规模发酵生产纤维素酶和纤维素酶在生产中的应用打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

黑曲霉B3菌株，实验室保藏

1.1.2 培养基

固体培养基（平板、斜面）:马铃薯20g,葡萄糖2g,琼脂2g,PH自然种子培养基：PDA液体培养基发酵培养基[13]：液体发酵培养基(质量分数):碳源5%、氮源1%、KH2PO40.05%、Mg SO47H2O 0.05%。

将上述所有培养基均在1.0×10Pa、121℃灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培养

种子活化：在平板上划线，挑取单菌落接种到斜面培养基中，置于30℃培养4～5 d。种子液培养：250mL三角瓶装入种子培养基50mL，接入菌种三环,转速150r/min，30℃下振荡培养72h～168h。

发酵培养：5%～10%接种量，28℃～32℃，150r/min振荡培养60h～96h，制备粗酶液。

1.2.2 粗酶液制备

发酵液先初步过滤，再经5000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。酶活测定时需用磷酸缓冲液做适当稀释。

1.2.3 酶活测定

1.2.3.1 羧甲基纤维素酶活（CMC）测定

实验组加入适当稀释的粗酶液0.5mL和0.5%CMC溶液1.5mL，空白对照管中加入2.0mL 0.5%CMC溶液。60℃水浴保温30min。向试管中加入3.0mLDNS试剂，沸水浴10min，540 nm测吸光值。酶活力单位规定：每mL酶液1min水解底物产生1m g葡萄糖的酶活力为1个活力单位(U/mL)。

1.2.3.2 滤纸酶活（FPA）测定

实验组取适当稀释的粗酶液0.5m l，加入PH 4.0的柠檬酸缓冲液1m l，空白对照组加入PH 4.0的柠檬酸缓冲液1.5ml，将实验组和空白对照组中在60℃水浴中预热2～3min，再在每个管子内加入50mg的滤纸条30min后加入3mlDNS试剂，立即转入沸水浴5min后，浸入冷水快速冷却，在540 nm测定吸光值。每mL酶液1min水解底物产生1m g葡萄糖的酶活力为1个活力单位(U/mL)。

1.2.4 黑曲霉B3产纤维素酶条件优化

前期通过单因素实验来确定发酵培养基的最佳的碳源、氮源、培养温度和最佳产酶时间，以便得到最有利于产酶的培养条件。

后期在初步优化的产酶培养基的基础上，通过design expert8. 06软件来进行设计，利用Plackett-Burman设计从经初步优化的培养基成分、培养条件中筛选出对酶活具有显著影响的3个因素，之后针对这3个显著影响因素以及它们的正负效应进行设计，利用最陡爬坡实验逼近响应值（最大酶活力区域），最后用响应面法设计进行试验。通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优产酶条件，并进行验证。

1.2.5 纤维素酶的分离纯化

发酵液使用硫酸铵分级沉淀，将40%-50%浓度沉淀部分（含有纤维素酶活部分）使用14kD的透析袋进行透析；透析液在浓缩仪上浓缩后采用SephadexG75进行凝胶过滤，活性部分使用阳离子交换柱进一步纯化。脱盐后能够得到纯度较高的纤维素酶组分。

1.2.6纤维素酶酶学性质研究

对纤维素酶进行酶学的理化性质研究，测算纤维素酶的酶活力、最适酶活温度、pH值、酶失活的温度范围，以及酶的米氏常数和最大反应速度等具体生化指标。

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉B3产纤维素酶条件的优化

通过单因素实验和响应面实验（图1）分析结果表明，优化后的产纤维素酶液体发酵条件为：小麦秸秆2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，发酵时间73.08h，接种量为8.004%，150r/min振荡培养。在此条件下，做3组验证实验，得到滤纸酶活力的平均值为153.4U/m l，比初始酶活力73.5U/m l提高了108%。

2.2 纤维素酶的初步纯化

在利用Sephadex G75凝胶柱纯化纤维素酶的过程中，每一步都测定洗脱液的纤维素酶活力和总蛋白含量，确定纯化过程中纤维素酶回收率和纯化程度，结果见表1。纯化后的纤维素酶与粗酶液对比，纯化倍数2.4倍，回收率43.2%。

表1 纤维素酶的纯化步骤

2.3 纯化的纤维素酶酶学性质的研究

2.3.1 纯化纤维素酶的最适反应温度

将纯化的纤维素酶样品分别在30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0℃下测定其酶活，结果如图2所示，从图中可以看出，纯化纤维素酶在60℃时酶活力最高，具有一定的热稳定性。

图2 纯化纤维素酶的最适温度（■）和温度稳定性（◆）

2.3.2 纯化纤维素酶的最适反应pH值

将纯化的纤维素酶在不同pH（4.0～9.0）下测定其酶活，结果如图3所示，从图中可以看出此菊粉酶在pH值为6.0时酶活达到最高，酶活力在pH5.5～7.0之间保持稳定。

图3 pH值对纯化的纤维素酶活力（◆）与稳定性（■）的影响

图4 不同金属离子对纤维素酶活性的影响

2.3.4 蛋白抑制剂对纯化纤维素酶酶活的影响

将纯化的纤维素酶加入碘乙酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸钠）和PMSF（苯甲基磺酰氟）等蛋白抑制剂后在4℃下放置30min，测定酶活，结果如图5所示。从图中可以看出，当存在EDTA时，由于EDTA将金属离子螯合，对纤维素酶活力有一定影响，但不会被完全抑制。而纤维素酶在PMSF存在时酶活力大幅下降，抑制效果非常明显。PMSF能专一性作用于丝氨酸，这表明我们纯化纤维素酶的活性中心可能含有丝氨酸残基。

图5 不同酶抑制剂对纤维素酶活性的影响

2.3.5 米氏常数Km和最大反应速度Vmax

通过在不同浓度底物CMC溶液中测定纤维素酶的反应速度来确定纤维素酶的动力学常数Km和Vmax，利用双倒数作图法以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作图6，利用图6计算纤维素酶对底物CMC的

图6 双倒数法作图求Km和Vmax

米氏常数Km为24.0mg/mL，最大反应速度Vmax是0.09mg/min。

3 结语

本文用单因素实验和响应面法对黑曲霉B3菌株产纤维素酶培养条件进行了优化，确定了黑曲霉B3产纤维素酶的最优条件：小麦秸秆2.5%，酵母膏2.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，pH 6.3，31.58℃，发酵时间73.08h，接种量为8.004%，150 r/min振荡培养，此条件下黑曲霉B3发酵液的FPA酶活力为153.4U/mL，比初始酶活力73.5U/ml提高了108%。将粗酶液初步纯化后，对纯化纤维素酶的酶学性质进行了初步研究，确定了其最适温度为60℃，最适pH值为6.0；Ca2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Li+、Na+、Cu2+和K+（1.0mM）对纤维素酶酶活有一定的促进作用，而Mg2+、Ag+、Hg2+（1.0mM）则对纤维素酶有抑制作用；蛋白抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）对纤维素酶具有强烈抑制作用；利用双倒数做图法法计算纤维素酶对底物CMC的米氏常数为24.0mg/mL，最大反应速度为0.09mg/min。

本文通过对黑曲霉产纤维素酶条件的优化以及对纤维素酶的酶学性质进行研究，为黑曲霉纤维素酶的发酵生产提供了理论基础，为秸秆的预处理和秸秆纤维素乙醇的生产提供了一条新的纤维素酶来源，具有一定的应用前景。

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张曈（1981—），男，山东泰安，博士，讲师，主要研究方向为生物质能源。

国家自然科学青年基金（21406083）；江苏省自然科学青年基金（BK20130416）；淮安市科技支撑计划（HAG2011015）。