谭令辞，刘雄伦* ，杨婷婷，行 璇，梁 毅，陈海龙，杨丰宇，李永聪，刘金灵，戴良英，陈立云，王国梁

(1湖南农业大学农学院，长沙410128;2作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128;3中国种子集团有限公司，湖北武汉430206;4湖南农业大学植物保护学院，长沙410128)

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物，全球半数以上人口以稻米为主食［1］。由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病(rice blast disease)是水稻最主要的真菌性病害之一，流行年份可使水稻减产10%～30%，是水稻高产稳产的主要限制因素［2］。实践证明，利用广谱、持久抗性基因培育和推广抗病水稻品种是控制稻瘟病危害最经济和环保的有效措施［3，4］。然而，由于受多种因素的影响，在常规抗病育种中对表型的选择往往不够准确，育种效率低。分子标记辅助选择(molecular markerassisted selection，MAS)育种，是通过基因型鉴定和分析对目标性状进行选择，选择效率大大提高，常用于连续回交育种定向改良受体个别性状，且没有转基因生物安全性评价的繁琐程序，是现代分子育种的重要手段［5，6］。Pi9是一个已克隆的广谱、持久抗稻瘟病基因，位于水稻第6号染色体短臂靠近着丝粒位置［7，8］。本研究以籼稻品系 75－1－127作为Pi9基因供体亲本，早籼稻品种1701作为受体亲本及轮回亲本，利用Pi9基因内特异DNA分子标记开展MAS育种，经过连续多代回交并自交，获得1个抗稻瘟病水稻新品系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

Pi9基因供体籼稻亲本及稻瘟病室内接种抗病对照75－1－127;稻瘟病室内接种感病对照水稻品种Co39;Pi9基因受体早籼稻亲本1701(湖南农业大学水稻科学研究所培育);16份来自国内外不同稻区的稻瘟菌菌株(表1)。以上材料均由本课题组收集保存。

1.2 方法

1.2.1 分子标记的开发

Pi9属于NBS－LRR类基因，含有2个内含子，长度分别为5 362 bp和128 bp;cDNA全长4 009 bp，包括3 099 bp的编码区和910 bp 3'UTR。本研究在Pi9基因第1个内元序列中设计1个基于PCR技术的特异功能标记Ins2－1(正向引物序列为5'－AACTGTTTTAAACACTCGGGTGGATA －3'，反向引物序列为5'－CACGATGATAACTTGGGCTAGGG CG－3')，分析Ins2－1在75－1－127和1701之间的多态性，并利用它对各回交世代及BC6F2自交群体进行基因型选择。

1.2.2 模板DNA的提取与标记基因型鉴定

对供体、受体亲本及回交或自交群体候选单株，各取约0.2 g新鲜幼嫩叶片置于2.0 mL离心管中液氮研磨，CTAB 法［9］提取总 DNA。

利用Ins2－1标记引物对各DNA样品做PCR扩增。PCR 反应体系(10 μL):DNA 模板1.0 μL，5 U/μL r－ Taq 0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL Primer pairs 1.0 μL，10 Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR反应程序:94℃预变性5 min，94℃变性 50 s，50℃退火 50 s，72℃延伸 40 s，35 个循环，72℃延伸5 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳并分析其带型。

1.2.3 分子标记Ins2－1的选择效率分析

2014年，将1701×75－1－127的 BC6F1群体及双亲播种于浏阳大围山病圃，使其自然发病，5叶期调查BC6F1单株苗瘟获得抗性表型，同时用Ins2－1鉴定对应单株的标记基因型，以此分析和检验分子标记Ins2－1对表型的选择效率。

1.2.4 BC6F2群体主要农艺性状调查

用Ins2－1对1701×75－1－127的BC6F1群体中随机单株做基因型鉴定，将Pi9基因的阳性单株套袋自交并混合收种，构成BC6F2改良群体。为确定BC6F2代的遗传背景是否已接近受体亲本，需要比较BC6F2群体与受体亲本1701的主要农艺性状。2014年，2个群体各随机选取10株定点调查分析，所调查的农艺性状包括全生育期、株高、剑叶长宽比、穗长、单株有效穗数、每穗总粒数、结实率、千粒重。记载标准参照文献［10］。相关数据采用Excel和DPS软件处理分析。

1.2.5 分子标记辅助选择育种获得抗病纯系

用Pi9基因供体亲本75－1－127与受体亲本1701杂交获得F1代，用受体亲本1701作轮回亲本连续回交获得各回交世代。每代于田间种植约20株，苗期分单株编号取样并提取总DNA，用分子标记Ins2－1做各单株基因型鉴定，并结合田间综合农艺性状选择确定5～10个候选单株，用于与轮回亲本回交并混合收种。通过2009～2013年长沙—三亚两地穿梭育种获得1701×75－1－127的BC6F2群体，于2014年夏季在长沙单株播种，再次利用分子标记Ins2－1辅助选择获得Pi9阳性单株，各单株套袋自交获得BC6F3株系。对各BC6F3株系做标记基因型和抗病性分析，筛选抗稻瘟病纯系。

1.2.6 室内接种表型鉴定

用于室内接种抗菌谱分析的水稻材料包括75－1－127、1701及感病对照 Co39，稻瘟菌菌株16份。用于1701×75－1－127各BC6F3株系表型鉴定的稻瘟菌菌株为87－4。供试材料播种于装有营养土的32孔塑料连板(20 cm×15 cm×30 cm)中，人工气候室温度26～28℃，正常光照培养至4叶期。采用单个菌株约1×105个/mL浓度的孢子悬浮液活体喷雾接种后，经过26℃高湿暗培养24 h，再进行5～6 d的正常光照高湿培养。参照Bonman的0～5级标准调查病情(0～2级为抗病类型，3～5级为感病类型)［11］。

2 结果与分析

2.1 供试亲本水稻的稻瘟病抗性表现与抗菌谱

利用16份来自国内外不同稻区的稻瘟菌菌株分别对供体亲本、受体亲本及感病对照室内接种，获得的抗性表现和抗菌谱结果如表1。各供试材料的抗性表现和抗菌谱差异显著，Pi9基因供体亲本75－1－127对来自国内不同省份的14份菌株均表现抗病，但不抗来自韩国的ROR1和来自日本的KOH，抗性频率为87.5%;受体亲本1701对包括ROR1和KOH在内的8份菌株表现感病，对来自国内的6份菌株(E2007046A、RB6、X2007A －1、CHL645、RB14、195－2－2)表现抗病，抗性频率为37.5%，表明其稻瘟病抗性确需改良;两亲本在8份菌株的抗性表现上存在差异，可用于MAS育种的表型验证;感病对照Co39对所有供试菌株均表现感病。

表1 供试水稻材料的稻瘟病菌抗谱Table 1 Resistance spectrum of the tested rice line to sixteen M.oryzae isolates

2.2 分子标记Ins2－1的多态性与选择效率

用分子标记Ins2－1分别对供体和受体亲本的基因组DNA模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析标记基因型，结果在75－1－127基因组中扩增出1条532 bp的清晰条带，而在1701基因组中无扩增产物，说明Ins2－1是1个在双亲间多态性明显且稳定的显性DNA分子标记，可用它开展MAS育种改良受体稻瘟病抗性。

为检验Ins2－1标记基因型在MAS育种中对稻瘟病抗性表型的选择效率，将1701×75－1－127 BC6F1群体播于田间病圃发病后，随机选取单株调查分析其表型与基因型。结果在Pi9基因供体75－1－127和所有BC6F1抗病单株中均扩增出1条532 bp的清晰条带，而在受体亲本1701和所有感病单株中均无扩增产物(图1)，表明本试验中Ins2－1标记基因型对回交后代的表型选择效率为100%。

图1 分子标记Ins2－1对1701×75－1－127 BC6F1群体的表型选择效率Fig.1 Phenotypic selection efficiency of molecular marker Ins2－1 for 1701×75－1－127 BC6F1population

2.3 BC6F2群体的主要农艺性状表现

1701×75－1－127的BC6F2群体与受体亲本1701的主要农艺性状调查分析结果见表2。结果表明，2个群体在生育期、株高、株叶形、产量构成因素等主要农艺性状表现上均无显著性差异，说明通过连续多代回交与自交，BC6F2改良群体的遗传背景已经与受体亲本非常接近，即它们实际上已是近等基因系(除Pi9基因差异)。

表2 1701×75－1－127 BC6F2群体及1701主要农艺性状分析Table 2 Analysis of the agronomic characteristics of 1701×75－1－127 BC6F2population and 1701

2.4 抗稻瘟病水稻纯系的鉴定与筛选结果

用分子标记 Ins2－1鉴定1701×75－1－127 BC6F2群体中的单株基因型，确定含有Pi9基因的单株套袋自交获得数个BC6F3株系。为明确各BC6F3株系中Pi9基因是否已经纯合，继续用Ins2－1进行基因型鉴定，同时用稻瘟菌菌株87－4室内接种分析抗性表型是否分离，结果获得1个基因型和表型均无分离的抗病纯系(图2)。该株系的遗传背景已与受体亲本1701非常接近，主要农艺性状与1701无显著差异，暂命名为“抗瘟1701”，为进一步培育抗稻瘟病水稻新品种(组合)打下了基础。

图2 稻瘟病抗病纯系的基因型和表型鉴定Fig.2 A blast resistant rice pure line was identified by genotypic and phenotypic analyses

3 小结与讨论

在常规抗稻瘟病育种中，由于环境等多种因素的影响，对表型的选择往往不够准确，育种效率低。MAS育种是通过标记基因型分析和选择代替表型选择，选择准确性和育种效率大大提高。笔者利用已克隆的广谱、持久抗瘟基因Pi9的序列信息，开发出1个基因内特异功能标记Ins2－1，用它开展MAS育种，定向改良一些感病水稻品种(特别是杂交稻亲本)的稻瘟病抗性［12～14］。实践证明，分子标记Ins2－1在Pi9供体亲本75－1－127与多份待改良的受体亲本间存在明显稳定的多态性，可利用它同时改良各受体的稻瘟病抗性。本研究中，Ins2－1标记基因型对抗病性表型的选择效率为100%，利用该标记在各回交及自交世代中连续辅助选择，育成了1个抗病纯系“抗瘟1701”，为培育抗病水稻新品种(组合)打下了基础。

Ins2－1是1个显性标记，不能区分抗病纯合子与杂合子。我们将基于Pi9基因的序列特点开发新的共显性标记，进一步提高MAS育种效率。本研究获得的抗病纯系“抗瘟1701”，还需进一步鉴定其抗菌谱以及在不同稻区的田间抗性。虽然Pi9基因是一个广谱、持久抗性基因，但它对来自韩国的菌株ROR1和来自日本的菌株KOH没有抗性。下一步将利用抗菌谱不同的另一广谱抗性等位基因Pigm［14］，先将2个等位基因非等位化，再进行双基因聚合育种，以培育抗谱更广、抗性更强的水稻新品种。

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