王筱翔，林庆胜，尹 飞，胡珍娣，陈焕瑜，沈斌斌，陈小帆，冯 夏*

(1.华南农业大学资源环境学院，广州 510642;2.广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640;3.广东出入境检验检疫局，广州 510623)

小菜蛾Plutella xylostella(L.)属鳞翅目Lepidoptera 菜蛾科Plutellidae，是为害十字花科蔬菜的一种重要世界性害虫，亦是抗药性最严重的蔬菜害虫之一，常对十字花科蔬菜的生产造成毁灭性破坏(Sarfraz et al.，2005)。在我国，随着大量化学杀虫剂的广泛使用和滥用，其抗药性水平不断提高，几乎对所用过的杀虫剂都产生了较高的抗药性，严重威胁着十字花科蔬菜的安全生产和发展。抗药性机理的阐明是抗性早期监测和治理措施研究的基础，对制定科学合理的用药策略具有重要的理论意义和生产价值。昆虫对杀虫剂抗药性的产生和发展是其为适应环境而不断改变自身行为及抗性基因不断选择的结果，往往涉及到一系列蛋白质的表达调控和相互作用。从蛋白质组学的角度分析调控抗药性的基因，将有利于从蛋白质错综复杂的互作关系中探索抗药性机制，为抗性治理措施的研究提供基础。

蛋白质组学是研究昆虫细胞组成与功能，免疫反应复杂性的重要途径(刘凯于等，2006)。广泛应用于昆虫发育生物学、免疫学、抗药性机理、寄生虫与寄主互作机理等领域的研究(Biron et al.，2005;李凯等，2005)。作为筛选、鉴定抗性相关蛋白的常用技术(Zhang and Guo，2011)，蛋白质组学可以从差异蛋白质组水平全面展示抗性形成和发展过程中昆虫体内蛋白质错综复杂的变化情况，但其分析结果容易受到多方面因素的影响，尤其是前期处理，蛋白质的提取方法对实验分析结果影响很大(黄艳红等，2012)。为建立适用于小菜蛾抗药性机理蛋白质组学研究的蛋白质提取方法，本研究比较了TCA-丙酮沉淀法，Tris-饱和酚抽提法和两种直接裂解法，并针对具体的研究材料作了相应修改，以便为小菜蛾抗药性机制的蛋白质组学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试昆虫:小菜蛾采自广东惠州，人工气候室(温度24℃±1℃，光周期16L∶8D，相对湿度60%-80%)饲养。每个处理收集3 龄小菜蛾幼虫50 头，4 次重复，称重后于-80℃冰箱保存备用。

1.2 蛋白质样品的制备

1.2.1 TCA-丙酮沉淀法

参考Salekdeh et al.(2002)方法，取冻存的3 龄小菜蛾幼虫放入预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，悬浮于10 倍样品提取液(10% TAC-丙酮溶液，40 mM DTT)中，4℃沉淀过夜，4℃、15000 r/min 离心30 min，弃上清。沉淀用10 倍体积的预冷含有10 mM DTT 丙酮溶液重悬，弹匀，4℃、15000 r/min 离心10 min，重复试验步骤重悬于冰丙酮2 次，干燥3 min。离心结束后加入蛋白样品裂解液(7 M 尿素，2 M 硫脲，4% CHAPS，2%两性电解质，40 mM DTT，1 mM PMSF)，超声5 min，4℃放置2 h，直至蛋白质粉末充分溶解，然后4℃、15000 r/min 离心30 min，取上清。

1.2.2 Tris-饱和酚抽提法

参考Xie 等人改良的饱和酚沉淀法(2009)，取冻存的3 龄小菜蛾幼虫放入预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状。加入1 mL 冰预冷的10%TCA 和2% B-巯基乙醇的丙酮溶液中，充分振荡后，4℃、15000 r/min 离心5 min，弃上清，沉淀用0.1 M 的醋酸铵/80%甲醇溶液洗涤1 次，再用80%的冷丙酮溶液洗涤1 次，沉淀室温干燥2 min。加入等体积的Tris-饱和酚溶液和dense SDS buffer(0.1 M pH 8.8 Tris-HCl，2% SDS，2% β-巯基乙醇，30% 蔗糖，1 mM PMSF)，混匀震荡温育5 min，4℃、15000 r/min 离心10 min，取酚层加入5 倍体积的0.1 M 的乙酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀过夜。然后4℃、15000 r/min 离心10 min，弃上清，沉淀用冷甲醇和80%丙酮洗涤2-3 次，真空离心干燥后加入蛋白样品裂解液(7 M 尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，2% 两性电解质，40 mM DTT，1 mM PMSF)，超声5 min，4℃放置2 h，直至蛋白质粉末充分溶解，然后4℃、15000 r/min离心30 min，取上清。

1.2.3 直接裂解法

取冻存的3 龄小菜蛾幼虫2 份分别放入预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用2种蛋白裂解液(RIPA Lysis Buffer，I-PER Reagent)直接裂解蛋白。具体方法为取一份研磨好的蛋白粉末加入预冷的1 mL RIPA Lysis Buffer 混悬后，于4℃静置2 h，4℃、15000 r/min 离心30 min，取上清。取另一份研磨好的蛋白粉末加入预冷的1 mL I-PER Reagent 混悬后，于冰上静置10 min，4℃、15000 r/min 离心15 min，取上清。

1.3 蛋白样品的定量

样品蛋白浓度采用全波长酶标仪(Thermo Multiskan Spectrum)进行测定。TCA-丙酮沉淀法，Tris-饱和酚抽提法以牛血清白蛋白为标准蛋白，采用Bradford 法进行定量(Bradford，1976)。两种直接裂解法采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行定量。

1.4 SDS-PAGE 分析

SDS-PAGE 电泳所用分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。每条泳道蛋白质样品上样量20 ug。电泳条件为200 V，45 min，考马斯亮蓝R-250染色。脱色至背景透明后用光密度扫描仪GS 800 扫描，利用Quantity One 软件进行图像分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质标准曲线

2.1.1 牛血清白蛋白标准曲线

TCA-丙酮沉淀法、Tris-饱和酚抽提法提取的蛋白定量以牛血清白蛋白为标准蛋白，采用Bradford 法建立标准曲线，所得标准曲线如图1 所示。其曲线方程为y=14.43x-0.1177，线性相关系数R2为0.9936，说明该曲线可信度较高，可以作为蛋白浓度测定的依据。

2.1.2 BCA 蛋白质标准曲线

图1 Bradford 法蛋白标准曲线Fig.1 Protein standard curve of Bradford

两种直接裂解法提取的蛋白质浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，所得标准曲线如图2所示。其曲线方程为y=1487.4x-23.384，线性相关系数R2为0.9969，说明该曲线可信度较高，可以作为蛋白浓度测定的依据。

图2 BCA 法蛋白标准曲线Fig.2 Protein standard curve of BCA

2.2 蛋白质样品溶解性与纯度

TCA-丙酮沉淀法所提取的蛋白干燥后为淡褐色沉淀，加入蛋白裂解液后，呈淡黄色溶液，并有白色不溶物出现，溶解性较低;Tris-饱和酚抽提法所提取的蛋白干燥后为白色沉淀，加入蛋白裂解液后为无色澄清液体，蛋白溶解性强，纯度高;直接裂解法所提取的蛋白为淡绿色澄清溶液，溶解性强，但其中含有色素等杂质，蛋白纯度相对较低。

2.3 蛋白提取率的比较

4种方法对小菜蛾全蛋白的提取率如图3 所示。其中直接裂解法RIPA Lysis Buffer 对蛋白的提取率最高，为52.06 mg/g，其次为I-PER Reagent提取率为46.16 mg/g，常用的TCA-丙酮法提取率为34.58 mg/g，最后为Tris-饱和酚抽提法，提取率为27.39 mg/g。利用SPSS 19.0 统计软件，采用LSD，S-N-K 和Duncan 三种多重比较方法，对4种方法的蛋白提取率进行方差分析。其中两种直接裂解法与TCA-丙酮法，Tris-饱和酚抽提法的蛋白提取率差异显著(P＜0.01)，直接裂解法中RIPA Lysis Buffer 与I-PER Reagent 法蛋白提取率差异不显著(P＞0.05)，TCA-丙酮法与Tris-饱和酚抽提法的蛋白提取率差异也不显著(P＞0.05)。

图3 不同提取方法的蛋白产率Fig.3 The rate of protein extraction from different methods

2.4 蛋白质样品的SDS-PAGE 电泳图谱分析

对4种方法提取的小菜蛾全蛋白进行SDS-PAGE 电泳，并利用Quantity One 软件对凝胶图谱进行分析，结果如图4 所示。Tris-饱和酚抽提法得到的蛋白谱带数目最多，为32 条，在17.0 kDa-245 kDa 的范围内分布均匀，且条带清晰。TCA-丙酮法得到的蛋白谱带为30 条，但与Tris-饱和酚抽提法相比，在90.0 kDa-240.0 kDa 范围内缺失部分蛋白。两种直接裂解法虽然蛋白提取量高，但得到的蛋白谱带数目较少，其中I-PER Reagent 法有20 条，在75 kDa 附近蛋白表达量较大，蛋白条带不易清晰辨别;RIPA Lysis Buffer 法有17 条，大部分为高分子蛋白，小分子蛋白条带缺失明显。

图4 不同方法提取蛋白的SDS-PAGE 图谱Fig.4 The SDS-PAGE map of different protein extraction methods

3 结论与讨论

蛋白质提取率高，电泳条带丰富、清晰的提取方法是蛋白质组学研究中理想的前处理措施。在小菜蛾血淋巴蛋白质组学的研究中，TCA-丙酮法提取蛋白损失少，图谱均匀清晰，重复性好(蔡未来等，2011)。本研究中利用TCA-丙酮法提取的小菜蛾蛋白质具有提取率适中，SDS-PAGE 电泳蛋白条带数量较多，分辨率清晰，容易操作耗时少等优点。这可能与TCA-丙酮法中的蛋白酶抑制剂TCA 可有效抑制蛋白酶对蛋白质的水解，丙酮以及加入的DTT 可以去除样品中酚类，脂类及色素等干扰物质，提高蛋白条带背景的清晰度有关(林金科等，2003;Saravanan and Rose，2004;陈晶瑜等，2010)。

Tris-饱和酚抽提法，经过改良后，有效的利用TCA 与丙酮去除样品中的酚类，脂类及色素等干扰物质，再经过酚的抽提去除多糖，制备的蛋白溶解性强，SDS-PAGE 电泳蛋白条带数量多，分辨率高。但是具有蛋白提取率相对较低，酚的毒性和腐蚀性较大，操作繁琐，耗时长等缺点(赖童飞等，2009)。

两种直接裂解法提取小菜蛾蛋白时具有提取率高、操作简便、耗时少等优势，但所提取蛋白含有较多的色素、脂类等杂质，严重影响了蛋白条带的清晰度，同时亦损失了较多的小分子蛋白质，且提取试剂售价较高，增加了相应的实验成本。

综合分析，本研究所测试的四种蛋白质提取法中，TCA-丙酮法提取小菜蛾蛋白质具有提取率适中，蛋白质溶解性强，电泳条带数量较多、分辨率高，谱带清晰等优点，适合小菜蛾的蛋白质提取，将为小菜蛾抗性机制相关的蛋白组学相关研究提供帮助。

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