何庆元，向仕华，吴 萍，王松华，李正鹏，祝嫦巍，张晓红

(1.安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100;2.自贡市农业科学研究所，四川 自贡 643000）

世界农业生产发展所面临的重要难题之一是土壤盐渍化，世界灌溉地盐碱化的面积达1/3左右[1]，占可耕土壤的26%[2]。在我国大豆主产区(东北生态区)土壤盐碱化也十分严重[3]。栽培大豆虽然具有一定的耐盐能力，但在盐渍胁迫下，往往导致产量减少，品质降低[4]。

大豆的耐盐机理复杂，主要包括泌盐、大分子物质调节、离子摄入和区域化以及酶消除胁迫毒害等。已有的研究表明高盐离子浓度能够降低植物水分吸收的能力，Na+通过未知的受体作用，促使活性氧(ROS)分子，如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2.ˉ－)和羟自由基(HO·)等在细胞质中大量累积，最终作用到细胞核的组氨酸激酶受体蛋白(HKT)，对植物造成次级氧化胁迫，损伤膜脂、蛋白质和核酸等，改变细胞代谢，引起对植物的伤害[5－6]。植物为减轻活性氧对胞内生物大分子和细胞膜的伤害，最为重要的一类调节途径是利用保护酶系统，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等清除活性氧，从而降低盐胁迫引起的植物伤害作用[7－8]。适量的ROS能够诱导植物产生对生物和非生物胁迫的保护机制，但过高浓度的ROS导致过度的保护，最终造成对细胞的损伤[9]。本研究分析不同浓度NaCl胁迫对大豆同工酶的影响，为探讨大豆对盐胁迫的响应机理奠定一定的基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试大豆为“南农1138－2”，是奉贤穗稻黄单株选择获得的品系，具有高产、广泛的生态和地区适应性、综合性状优良特点，利用该祖先亲本育成或衍生了至少45个品种[10]。

1.2 试验设计

分别选取籽粒饱满的大豆种子，播种于装有蛭石的花盆中，置于温室大棚中，自然光照，待长出真叶后，选取长势一致的幼苗转至1/2 Hoagland营养液(pH 5.8)中培养至V2期[11]后，用NaCl胁迫处理。实验设置5 处理，分别为在 1/2 Hoagland 中分别添加至含 0.000mol/L、0.050 mol/L、0.075 mol/L、0.100 mol/L、0.125 mol/L浓度的NaCl，每个处理3个重复，每个重复1盆，每盆8株。

1.3 测定项目与方法

处理前后以子叶节为分界点，分别测量根长和茎长，根相对生长速率=(处理后根长－处理前根长)/(处理前根长*处理天数)，茎相对生长速率=(处理后茎长－处理前茎长)/(处理前茎长*处理天数)。

培养至V3期，分别采集各株倒二叶(完全展开的复叶)的中间小叶，重复内8株混合取样，每重复取0.30 g，立即用预冷的0.20 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)按料:液=1∶3，充分研磨至均浆，全部转移至离心管中，4℃ 10000 rpm离心20 min，取上清液，作为待测粗酶液。

酶活性测定:用考马斯亮蓝(G250)法测定可溶性蛋白含量[12]、用愈创木酚法测定POD活性[12]、用邻苯三酚自氧化速率法测定SOD活性[13]和用紫外吸收法测定CAT活性[12]。酶的活力单位用比活力单位即单位可溶性蛋白在每分钟吸光度的变化值，即:ΔA/(min·mg)。

同工酶电泳:3种同工酶都采用Tris－HCl缓冲体系，浓缩胶浓度为4%，分离胶为7%。POD和SOD以30V电泳7－8 h，至溴酚蓝至胶底端为止;CAT一直用30V电泳9 h。POD同工酶用联苯胺染色法[14]，SOD同工酶用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法[15]，CAT同工酶用改良的铁染色法[16]。

以子叶节为界剪断成为根和地上部分，经105℃杀青10 min，80℃烘干至恒重后分别称取根和地上部分干重。根冠比=根干重/地上干重。

1.4 数据分析

数据用Excel 2003和SPSS 13.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对大豆生长的影响

表1 不同浓度NaCl处理下大豆的根、茎相对生长速率，根和地上部分干重及根冠比Table 1 Soybean’s relative growth rate of root and stem，dry weight of root and aerial part，root/shoot ratio in different NaCl treatments

从表1可知，随NaCl浓度的升高，根和茎的相对生长速率降低，根和地上部分的干重减少，在没有NaCl胁迫下，生长最好。并且当溶液中NaCl浓度为0.050 mol/L时，根和茎的相对生长速率以及根干重都没用显著的差异，但地上干重显著减少。当溶液中NaCl浓度达到0.075 mol/L时，相对生长速率受到显著抑制，生物量显著减少。当溶液中NaCl浓度高于0.075 mol/L后，大豆根冠比显著增加，但当溶液中NaCl浓度达到0.125 mol/L后，根冠比和对照没有差异，这可能是因为在一定浓度的NaCl胁迫下，根的生长比地上部分要多，以期适应胁迫环境，但过高的NaCl浓度严重抑制了根和茎的生长，导致根冠比降低。

2.2 盐胁迫对大豆POD、SOD和CAT同工酶活性影响

表2 不同NaCl处理下大豆的POD、SOD和CAT活性Table 2 Activities of POD，SOD and CAT enzyme of soybean in different NaCl treatments

从表2可知，POD、SOD和CAT活性在不同浓度NaCl胁迫下表现为先升高，后降低，当NaCl浓度为0.050 mol/L时，虽然有一定的增加，但没有显著性差异。但当NaCl浓度达到0.075 mol/L及以上时，3种酶的活性都显著降低，并且随NaCl浓度的增加，酶活性进一步降低。这可能是在低浓度NaCl下，大豆通过激活了抗氧化酶系统活性，分解盐胁迫所产生的活性氧(ROS)分子，但过高浓度的NaCl导致抗氧化酶系统过度应急，细胞膜等的损伤，最终酶活性降低。

2.3 盐胁迫对大豆POD、SOD和CAT同工酶谱的影响

从图1可以看出在NaCl胁迫下大豆叶片中POD、SOD和CAT同工酶谱分别有8、6和1条酶带。其中POD酶谱的POD－1到POD－6在5个处理中都有酶带，只有在NaCl浓度在0.075 mol/L时具有所有的酶带，在0.100 mol/L时具有POD－8酶带。这表明当NaCl浓度增加到一定浓度时，会产生新的POD同工酶，但过高的NaCl浓度导致新产生的POD同工酶不表达。SOD酶谱在NaCl浓度从0.000到0.100 mol/L的4个处理都没有变化，当NaCl浓度达到0.125 mol/L时，检测不到SOD－3和SOD－5两条酶带，过高浓度的NaCl导致部分SOD同工酶不表达。CAT酶谱在5个处理都只有一个相同的酶带，酶谱没有差异。

3 讨论

Na+和Cl－是竞争性选择吸收离子，植物会优先吸收Na+和Cl－导致其他营养物质吸收减少[17]，在NaCl胁迫下植物细胞液泡中的H+和环境中的Na+发生交换进入植物细胞质中，过多的Na+和Cl－对植物产生毒害，导致作物产量和品质的降低。植物在一定浓度的Na+刺激下，能够激活一些抗氧化酶基因的表达[5]，缓解ROS等的危害，但过量的ROS攻击蛋白质、脂质等生物大分子，使它们氧化降解，最终导致酶失活，增大生物膜透性[18]。植物的抗氧化酶系统具有一定的清除过量ROS能力[19]。本研究表明低浓度(0.050 mmol/L)的NaCl胁迫能够增强抗氧化酶活性，但NaCl增加到一定浓度后，可能是抗氧化酶的过度应急，最终导致活性降低，和前人研究的结果较为一致。

同工酶是指一组能催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构和理化性质等存在明显差异的酶。植物在盐胁迫下同工酶的种类也会产生一定的改变[20]。南农1138－2是基因型高度单一纯合的地方品种，同工酶表达的差异是相关基因受到盐胁迫诱导所致。本研究中POD和SOD同工酶在NaCl胁迫后谱带产生了一定的变化，可能是在一定浓度NaCl诱导下，植物为缓解盐胁迫，产生了新的同工酶，但过高的浓度，致使这些种类的同工酶表达受到损伤，最终不表达。然而，酶谱差异的表达还需要进行进一步的深入研究。

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