付文婷++张爱民++廖芳芳++韩世玉++何建文++杨红

摘要 采用0.1%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羟基喹啉和冰水3种试剂对辣椒辛香8号花药培养再生植株根尖进行预处理，研究不同预处理对根尖细胞中期分裂相的影响效果，并对辣椒花药培养再生植株进行倍性鉴定，以期获得辣椒染色体计数的最佳预处理。结果表明：3种预处理中，利用0.1%秋水仙素对辣椒根尖预处理3 h，细胞的中期分裂指数最高，达56.6‰，而且染色体分散度好，染色体分裂相多，比较适合染色体计数；经染色体计数鉴定得出5株花药培养再生植株中有4株双倍体和1株单倍体，可用于下一步育种实践中。

关键词 辣椒；根尖；预处理；倍性鉴定

中图分类号 S641.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）18-0077-02

Pretreatment for Pepper Root Tip and Plant Ploidy Identification

FU Wen-Ting ZHANG Ai-min LIAO Fang-fang HAN Shi-yu HE Jian-wen YANG Hong

（Pepper Institute of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550006）

Abstract Pepper Xiangxin8 root tip were pretreated with three reagents including 0.1% colchicine，0.002 mol/L 8-hydroxyquinoline and ice water to study the effect of different pretreatment on root tip cells in metaphase of pepper，and the ploidy was identified of another culture derived pepper plants to obtain well pretreatment for chromosome counting. The results showed that metaphase mitotic index was as high as 56.6‰ in the density of 0.1% colchicines and 3 hours treatment，which the chromosomes spreader well，more split phases，and were suitable for counting. 4 haploid and 1 diploid were identified in 5 regenerated plants by chromosome counting. These could be used for breeding.

Key words pepper；root tip；pretreatment；ploidy identification

辣椒属茄科辣椒属，原产地中南美洲，自17世纪40年代从中南美洲传入我国，育种工作者对其不断改进改良[1]，尤其可以通过花药培养快速获得有价值的纯系用于培育新品种。但通过花药培养得到的再生植株，往往都是单倍体、双单倍体及其他倍性复杂的混合群体，有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用的基础。因此，通过染色体根尖压片技术进行细胞倍性鉴定是最直接和最可靠的方法，计数准确，不需要复杂的仪器，是目前应用广泛的鉴定方法[2-3]。染色体压片计数，计数的最佳时期是有丝分裂中期的染色体。但是，在有丝分裂周期中，分裂中期的持续时间很短，只有10～30 min。因此，中期分裂相所占比例很小。此外，由于分裂中期的染色体紧密排列在赤道面上，又有纺锤丝的牵制，所以，在制片中往往很难将其分散开。尤其是染色体比较大或数量较多时，很容易产生染色体的严重重叠，不仅不能识别单条染色体形态，而且连计数也困难[4]。为了克服上述困难，在染色体制片时，一般需要用化学或物理方法对材料进行预处理。在具体实践中，由于取材不当而导致制片失败经常发生[5]。而辣椒的染色体小，且数目较多，因此要通过常规的压片程序很难得到分散度高和分类相多的制片，近年来，有关辣椒辣椒染色体制片的报道也比较少[6-8]，在辣椒染色体制片一般以辣椒根尖为试材，其取材方便，是观察细胞分裂的良好材料[9]。在取材适宜的条件下，染色体制片成功与否最关键的步骤便是材料的预处理。本研究采用秋水仙素、8-羟基喹啉和冰水对辣椒根尖染色体进行预处理，为辣椒花药培养再生植株的鉴定和根尖染色体观察找到适宜的预处理。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为辣椒辛香8号花药培养再生植株，由贵州省辣椒研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 辣椒根尖染色体制片法。具体包括：①根尖培养。通过花药培养的辛香8号再生植株，方法参照付文婷等[10-11]研究。将再生植株放入生根培养基MS+0.01 mg/L NAA（蔗糖25 mg/L+琼脂7 mg/L，pH值5.8）中，放置到光照强度为2 000 lx，光照时间为16 h/d，温度为25 ℃下发芽并培养根系发达的壮苗。待组培苗根达1 cm时于8：00—10：00取细胞分裂旺盛期的根尖进行预处理。②根尖预处理。分别用浓度0.1%秋水仙素和0.002 mol/L的8-羟基喹啉分别对根尖浸泡处理3～4 h；冰水处理24 h，虽然处理时间长，但对处理材料不会产生药害，可有效将有丝分裂停留在中期[12]。③固定。将经过预处理的根尖先用蒸馏水冲洗3～5次，再放到卡诺固定液（3份无水乙醇∶1份冰醋酸）中固定24 h。固定后可用95%乙醇浸泡20 min，后转入85%乙醇浸泡20 min，然后转入70%乙醇中在4 ℃冰箱中保存备用。④解离和染色。从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗3～5次，再放到0.1 mol/L HCl中，在65 ℃水浴中解离5～8 min。将解离好的根尖用水冲洗后将根尖放到卡宝品红染色剂中染色。⑤压片和镜检。取1根染色后的根尖置于载玻片上，取根尖近0.05 cm处的根尖，滴少量的染色剂，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头端轻轻敲打盖玻片，用吸水纸将多余渗出的染色液吸干。将压好的片子置于奥林巴斯（IX71）60×物镜下观察并照相。endprint

1.2.2 辣椒花药培养再生苗倍性鉴定。剪取再生苗的根尖进行染色体压片，采用染色体计数法，确定再生苗的倍性水平。

1.2.3 观察与统计。每个处理样品取3个根尖压片观察，记录每个片子3个视野内观察到的总细胞数、分裂的细胞数和中期分裂细胞数。有丝分裂指数是指处于有丝分裂期的细胞数与被观察的细胞总数之比，用千分率表示，以此来测定根尖细胞的有丝分裂活性。中期分裂相指数指处于分裂中期细胞数与被观察的细胞总数之比。用千分数表示，以此测定根尖细胞的经预处理后处于中期细胞数的比例[13]。

2 结果与分析

2.1 不同预处理对辣椒中期分裂相的影响

用0.1%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羟基喹啉和冰水处理分别处理辣椒根尖细胞对有丝分裂产生的影响不同。由表1可知，用0.1%秋水仙素处理3 h时根尖细胞的中期分裂指数最高，达56.6‰，其次是0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h时，中期分裂指数是30.6‰，而冰水处理24 h根尖细胞的中期分裂指数最低，只有15.7‰。说明用0.1%秋水仙素处理辣椒根尖时效果最佳。

2.2 不同预处理对辣椒根尖细胞倍性鉴定的影响

用0.1%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理3 h和冰水处理辣椒根尖24 h。由图1可知，3种预处理的试剂均能将根尖细胞的有丝分裂停留在中期，但冰水处理的染色体分裂相少，分散度差，粘连严重，染色体较短，不利于染色体计数（图1c）。0.1%秋水仙素处理的染色体分散度好，染色体分裂相多，比较适合染色体计数（图1a）；经0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理的染色体分裂相（图1b）居于0.1%秋水仙素和冰水之间，但其染色体分散度不理想，易粘连，染色体数很难区分。

2.3 辛香8号辣椒花培再生植株根尖染色体倍性鉴定结果分析

在前期研究的基础上，对获得的5株辛香8号花药培养再生植株进行倍性鉴定。将其根尖经0.1%秋水仙素进行3 h预处理，再进行固定、染色、压片和观察发现（图2），5株再生植株中，4株为二倍体，n=24（图2a），只有1株为单倍体n=12（图2b），为正常倍性辣椒细胞染色体数目的1/2。

3 结论与讨论

在根尖染色体压片技术中，在有丝分裂中能否把细胞停留在中期，预处理起到至关重要的作用[14]，预处理不仅使中期分裂相的细胞增加，还能有利于分散，便于染色体的计数。本试验利用3种不同的预处理试剂对辣椒根尖进行处理，结果发现不同的试剂对辣椒根尖的中期分裂指数影响不同，0.1%秋水仙素处理的根尖细胞的中期分裂指数最高，且染色体不会发生断裂、丢失现象。这与赛尔兰·热合买提等[15]研究一致。而江力榕等认为冰水预处理24 h使辣椒根尖可以获得数目较多，分散均匀的辣椒根尖细胞染色体早中期分裂相[16]，这与本试验结果不一致。可能与预处理的温度、时间和试剂多种因素的影响有关。但在预处理根尖材料试验中，一定要掌握好根尖细胞的分类高峰的时间段，这样才能获得更多的分散良好的中期细胞。

在花药培养中，早期及时有效的倍性鉴定是构建DH群体十分关键的技术环节，也关系到单倍体的育种进程[17]。利用染色体压片计数法对辣椒进行倍性鉴定是最直接、可靠的方法。研究发现利用0.1%秋水仙素处理3 h对染色体计数效果最佳，分散度好且不粘连，便于染色体计数来鉴定植株倍性水平。

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