钱明媚，肖永良，彭文涛，曹 慧（南京农业大学生命科学学院，农业部农业环境微生物工程重点实验室，江苏 南京 210095）

免耕水稻土固定CO2自养微生物多样性

钱明媚，肖永良，彭文涛，曹 慧*（南京农业大学生命科学学院，农业部农业环境微生物工程重点实验室，江苏 南京 210095）

使用13CO2为标记物，采用稳定性同位素核酸探针（DNA-SIP）技术和微宇宙模拟的方法，对两种南方免耕水稻土中的固定CO2自养微生物群落结构和多样性进行了研究.实验结果表明，经80d的培养后，从13CO2标记处理的土样提取的DNA经氯化铯密度梯度离心后其浮力密度显著区分于12CO2对照组，表明土壤样品中的固定CO2自养微生物对CO2具有同化利用.RT-PCR结果表明两种标记土样DNA密度梯度离心分层的cbbLR基因的拷贝数最高分别为1.36×105拷贝/g干土和2.21×105拷贝/g干土.克隆文库分析和系统发育分析表明两种土壤中的固定CO2自养微生物群落结构具有一定差异.Bradyrhizobium和Rubrivivax是为FG土壤中的主要类群， 占全部克隆数的60.40%和13.86%.而TF土壤的主要类群是Rhodopseudomonas、Rhodospirillum、Methylibium和Variovorax，分别占全部克隆数的20.90%、11.94%、16.42%和10.45%.两种13CO2标记土样的cbbLR基因文库OTU类型、多样性指数均高于12CO2对照文库，其群落结构也有明显的变化.因此，免耕水稻土存在高度多样性的二氧化碳固定自养微生物，在农田土壤碳素循环方面具有重要作用.

固碳微生物；免耕水稻土；cbbLR基因；DNA-SIP；PCR-RFLP分析

温室气体排放导致气候变暖和海平面上升，引起了全球的广泛关注.大气中的温室气体主要是由CO2、CH4、N2O三种气体组成［1］，其中CO2对温室效应影响最大，占总效应的50%左右［2］.土壤是温室气体的主要排放源之一，大气中约有5%～20%的CO2来自土壤［3-4］；同时土壤中广泛存在不同种类的自养微生物，它们能够通过不同的代谢途径固定二氧化碳［5］.土壤生态系统是二氧化碳的源或汇，在很大的程度取决于土壤呼吸和二氧化碳固定的对比关系，与土壤微生物的数量、种类和活性等密切相关，并受气候条件、植被类型、耕作方式和土壤理化性质的综合影响［6-10］.

自养微生物包括光能自养微生物和化能自养微生物两种类型，它们具有环境适应性强、种类多、数量大、分布广的特点，能够直接固定二氧化碳.Miltner等［11］应用同位素示踪技术室内模拟培养试验研究结果表明，农田土壤微生物对CO2的固定量最高可达呼吸排放量的3%～5%. Yuan等［12］研究表明，农田土壤自养微生物能将CO2转化成有机物质，其同化速率约为 0.0134～0.103g/（cm2·d）.由于不同类群的自养微生物进化出不同的 CO2固定途径，通过CO2固定关键酶基因设计保守性引物研究自养微生物多样性成为可能.Calvin循环是自养微生物固定CO2的主要途径，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是Calvin循环中的关键酶，能够利用环境中的CO2合成有机质［13］，对大气中CO2浓度调节发挥着重要作用［14-15］.Watson等［16］将固定CO2细菌分为 “Green-like”和“Red-like” 两大类群，RubisCO的部分编码基因cbbLR和cbbLG分别是它们的指示基因.由于cbbLR基因具有高度保守性，可以采用保守性引物分析环境样品中cbbLR功能基因的多样性，进而阐明二氧化碳固定自养微生物的分子生态学机制［17-18］.

稳定性同位素核酸探针技术是利用稳定性同位素标记底物培养环境样品，通过提取微生物基因组DNA或者RNA借助于其它分子手段来分析环境样品中同化了标记底物的微生物，从而揭示环境中微生物重要代谢过程的分子机制.Fan等［19］采用13C-DNA-SIP技术，发现我国东北黑土中能够利用秸杆有机碳的微生物分属3个门、19个属；Zhang等［20］用13C-CO2培养酸性土壤与12C-CO2对比，培养30d后，结合SIP技术分析发现酸性土壤中Thaumarchaeota中的氨氧化古菌（AOA）具有CO2同化功能.免耕是可持续农业的重要发展方向，可以极大地减少对土壤的扰动，提高土壤有机碳含量［21-22］，提高土壤微生物的活性和数量［23］.但免耕过程中由于土壤有机碳含量提高，参与碳素代谢的微生物有何变化，尤其是二氧化碳固定自养微生物多样性有何变化，直接影响到农田土壤的生态功能和环境效应.本研究采用微宇宙培养方法，选择两种免耕水稻土并设置13CO2标记与12CO2对照处理，直接示踪分析二氧化碳固定微生物多样性，为深入理解稻田土壤固碳过程提供一条新的思路，为调控土壤固碳能力提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 研究区域概况和土壤样品采集

实验样品于2013年12月采自安徽广德免耕稻田，该区属于亚热带季风气候，年均温为15.4℃，年均降水量1328mm.采集2种土壤类型样品，分别为铁渗潜育水耕人为土（FG）（119º12′54.17″E，30º55′53.75″N）和普通铁渗水耕人为土（TF）（119º18′53.57″E，30º53′52.28″N），两种类型土壤主要分布在低地势的冲田地形、耕作历史悠久的水稻田中，在皖南地区分布面积较大，有较好的代表性.用自制管式原状土采样器（直径25mm，高35mm）采集0～20cm表层土壤，去除石块和根系，带回实验室于4℃和-20℃分别储存备用.2种供试土壤的理化性质见表1.

表1 两种土壤样品的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the soils

1.2 CO2固定模拟试验

13CO2固定微生物模拟实验共设四组处理（FG-13CO2、FG-12CO2、TF-13CO2、TF-12CO2），每个处理设置4个重复.将采集的新鲜原状土均匀放置于密封透光的培养箱中，调节含水量至最大持水量的40%.培养箱密封后，在30℃条件下预培养14d，目的是为了减少土壤呼吸排出的CO2量，避免4%13CO2被稀释.正式培养周期为80d，每7d用压缩空气（20% O2，80% N2）换气2～3min，以维持好氧环境，换气结束后重新注入13CO2和12CO2气体，确保培养箱的CO2浓度为4%，30℃培养.80d取样，部分用于土壤总DNA提取，部分于-20℃保存备用.

1.3 土壤总DNA提取与密度梯度离心

1.4 自养固碳细菌关键酶基因cbbLR多样性分析

选取13CO2标记分层后荧光定量结果拷贝数较高的7，8两层（13C-7、13C-8）DNA样品为模板，选取对应的12CO2标记层（12C-7、12C-8）作为对照，扩增cbbLR基因，建立cbbLR基因文库.cbbLR-PCR产物用Hha I限制性四碱基内切酶进行酶切，基因型对应测序结果去载体序列处理后，与NCBI网站中的Blast比对分析.

1.5 统计分析

采用EXCEL和SPSS19.0进行相关的数据处理与统计分析，测序结果经NCBI比对后进行归类.

2 结果与分析

2.113CO2标记处理下二氧化碳固定细菌基因拷贝数量

从不同密度梯度分层样品中固碳细菌cbbLR基因的相对丰度（图1）可以看出，13CO2标记的两种土壤微生物cbbLR基因拷贝数最高均出现在第8层，而12CO2对照的cbbLR基因拷贝数最高出现在第10层，两个层级密度差约为0.008mg/mL.

图1 不同密度梯度分层样品中固碳细菌cbbLR基因的相对丰度Fig.1 Quantitative distribution of bacterial cbbLR gene copy numbers across the entire buoyant density gradient of the fractionated DNA from the soil

荧光实时定量PCR结果表明， FG13C-7基因拷贝数为5.69×104拷贝/g干土拷贝/g干土，而FG12C-7基因拷贝数为2.07×102拷贝/g干土；TF13C-7基因拷贝数为4.35×104拷贝/g干土，而TF12C-7基因拷贝数为1.47×102拷贝/g干土.FG和TF样品13CO2标记处理重浮力密度层DNA中cbbLR基因的拷贝数都高于12CO2处理两个数量级，表明13CO2标记处理样品的固定CO2细菌基因组DNA已被部分标记.两种土壤13C标记基因拷贝数最高都出现在第8层，其中FG13C-8基因拷贝数为1.36×105拷贝/g干土，而TF13C-8基因拷贝数为2.21×105拷贝/g干土.对于13C处理来说，重层基因拷贝数显著高于12C对照处理，且从第8层开始，拷贝数随着浮力密度的减小而降低，表明超高速离心将13C-DNA分离到重层.

2.2 二氧化碳固定细菌cbbLR基因多样性

选取13CO2标记超高速密度梯度离心分层后荧光定量结果拷贝数较高的两层（7，8层）DNA样品为模板，对应的12CO2标记层作为对照，使用cbbLR基因特异性引物从两种土壤共8个分层样本中均扩增出了cbbLR基因条带，PCR目的产物片段长度约为820bp，PCR产物经限制性内切酶Hha I酶切，酶切产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，分类后测序.

表2 8个分层样品cbbLR基因文库的群落多样性结构指数Table 2 Community diversity structural indices of the cbbLR gene libraries in the eight layered samples

图2 8个分层样品中固碳细菌cbbLR基因文库丰度曲线Fig.2 Rarefaction curves of the cbbLR gene clone libraries in the eight layered sample

构建了8个分层样品的cbbLR基因文库，包含672个阳性克隆.将测序结果相似性大于98%的序列归为同一种可操作分类单元（OTU） ，共得到30个OTU.8个基因文库的库容值在86.57%～97.39%之间（如表2），同时从各分层样品cbbLR基因文库的种系丰度曲线（图2）也可看出，建立的8个基因文库趋势线均趋于缓和，表明建立的基因文库能够较为完整地反映各分层样品中固碳细菌的群落结构.

从文库群落结构多样性指数（表2）可以看出，8个基因文库的各类多样性指数数值存在一定的差异，Shannon-Wiener指数的数值范围为1.35～2.77.13C标记的重层Shannon-Wiener指数均高于对应12C对照样品，且两种土壤13C标记的第8层多样性也都高于第7层.从均匀度和丰富度指数来看，8个cbbLR基因文库的均匀度都较高，TF土样的丰富度略高于FG，而且两种土壤13C标记的重层均匀度和丰度度都高于12C对照样品.

2.3 二氧化碳固定细菌群落结构与系统发育

为了比较cbbLR基因文库OTU类型差别，绘制了两种土壤13C标记和12C对照7～8层cbbLR基因OTU类型文氏图（图3）.由图3可看出，FG和TF均有27个OTU类型，其中FG和TF共有类型有24个OTU，占总OTUs的比例为80%.13C标记处理80d后，土壤FG出现了7个新的OTU类型，而土壤TF出现了4个新的OTU类型，并且缺少12C对照处理的部分OTUs类型，可见两种土壤在13CO2标记培养过程中，二氧化碳固定自养微生物的群落结构发生明显的变化.

将30个OTU类型的测序结果经NCBI比对后进行归类（表3），并计算出不同类群固碳细菌所占的百分比（图4）.两种土壤30个OTU序列之间的同源性为77.25%～98.21%之间，主要分布在5个目、9个科和12个已知属，即Rhodopseudomonas、Bradyrhizobium、Alcaligenes、Burkholderia、Rhodospirillum、Acidiphilium、Rubrivivax、Rhizobium、Cupriavidus、Azoarcus、Variovorax和Methylibium属.此外，还有1个unssigned和1个uncultured OTU类群.

图3 13CO2标记和12CO2对照的两种土壤cbbLR基因OTUs类型文氏图Fig.3 Venn diagram showing relationships between the two soils incubated with13CO2or12CO2in RFLP pattern based on cbbLR gene OTUs

图4 固碳细菌cbbLR基因基因文库所含类群百分比Fig.4 Percentage of each phylum contained in the cbbLR gene clone libraries

13C标记与12C对照处理土壤样品相比，不同浮力密度层固碳细菌种属分布和相对丰度不同，不同土壤类型固碳细菌种属分布和相对丰度也不同.土壤FG和TF分别有11和12个菌属，通过比较13C标记处理样品和12C对照处理样品第8层的固碳菌，发现Rhodopseudomonas、 Methylibium和Bradyrhizobium为两种土壤13C标记的共有优势菌属，土壤FG中相对丰度分别为8.91%、5.94%和60.40%，而土壤TF中的相对丰度分别为20.90%、16.42%和7.46%；Rubrivivax是土壤FG特有优势菌属，相对丰度为13.86%，而土壤TF特有优势菌属为Burkholderia、Azoarcus、Rhodospirillum和Variovorax，相对丰度7.46%、7.46%、11.94%和10.45%，可见两种水稻土中的二氧化碳自养微生物群落结构存在差异.将两种土样13C标记与12C对照处理比较，FG13C标记土壤中Bradyrhizobium、Methylibium和 Rubrivivax丰富度高于12C对照处理，而TF13C标记土壤中Rhizobium、Acidiphilium、Burkholderia、Variovorax、Alcaligenes、Methylibium和Azoarcus丰富度高于12C对照处理，表明13CO2标记处理土壤中自养微生物基因组DNA有更多被同位素标记.

表3 与测序克隆cbbLR序列最相似的NCBI基因库中微生物种类Table 3 Species of bacteria of cbbLR sequences in the NCBI GenBank database most similar to the clones of soil sample

3 讨论

采用DNA-SIP技术，结合PCR-RFLP方法，研究了免耕水稻土中二氧化碳固定自养微生物的多样性.土壤总DNA经超速离心分层后，发现13CO2标记处理7～9层中cbbLR基因的拷贝数均高于12CO2对照处理，且有差异明显，说明13CO2标记处理土壤中的CO2固定细菌基因组DNA被标记.13CO2标记处理样品中第8层cbbLR基因的拷贝数最高，而12CO2标记处理中cbbLR基因的拷贝数第10层最高，两者浮力密度相差约0.008mg/ml，表明13CO2对固碳微生物标记还不够充分.原因可能是自然界中固碳微生物多为兼性自养微生物，而严格自养微生物所占的比例较少，兼性自养微生物能够从环境中摄取小分子有机物作为碳源，导致13C标记只能部分掺入固碳微生物的DNA［26］.

通过对8个cbbLR基因文库分析发现，13CO2标记处理的7，8层的OTUs类型数均大于12CO2对照层，香农指数、辛普森指数和丰富度呈现同样的分布规律.13CO2标记处理土壤中cbbLR基因的拷贝数、OTU类型和多样性指数的增加，可能是由于较高浓度CO2（4000×10-6）有利于不同类型的自养微生物生长和繁殖，因而自养微生物数量和种类都明显增加.同时也提示在全球CO2升高后，土壤作为CO2重要的源和汇，对大气CO2有的一定负反馈调节作用，有固定大气CO2并减轻温室气体效应的潜力.Cannon等［27］指出，水体/海洋中自养微生物同化的CO2占水体/海洋吸收大气CO2总量的40%，自养微生物在水体/海洋碳同化过程中起着不可忽视的作用.另外，Yuan等［28］的研究显示，土壤中含有cbbL基因微生物的丰度与土壤有机质含量呈正比，且施肥和秸秆还田能增加该类群微生物的数量.这表明通过积极的农艺措施，可能在一定程度上实现耕地的碳截流的增加.

本研究分析了30个cbbLR基因序列的同源性，发现它们之间的同源性不高（77%～98%），这些序列与NCBI数据库中cbbLR相似性更低（75%～89%），这表明免耕水稻土特殊环境条件对微生物种群有较大的选择，在长期的进化过程中形成与其环境条件相适应的微生物群落结构，同时暗示免耕水稻土可能存在较多的新的自养固碳微生物类群.本研究中2种土壤中含有30个OTU类型，分属12个已知属和2个未知属，以兼性自养微生物为主.Wu等［29］对3种具有代表性轮作制度的农田土壤进行固碳微生物多样性研究，结果表明3种土壤固碳菌种类存在较大差异，与本实验的结果亦存在较大差异.袁红朝等［30］研究长期施肥对稻田土壤固碳菌群落结构和数量的影响，发现3种施肥处理土壤中165个cbbL基因型分布在14个细菌属.虽然细菌种属数量相近，但种属组成有很大差别，除Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas和Alcaligenes属外，其它种属都不相同.此外，FG水稻土中Bradyrhizobium占据了绝对优势，而TF稻田土壤中各菌属则分布相对均匀，二者优势菌属相对丰度存在明显差异，而这种差异在已报道自养微生物多样性研究方面普遍存在，遗传特性和土壤性质是造成这种差异的主要原因［6］.

二氧化碳固定自养微生物有光能型和化能型两种类型.Wu等［31］最新研究表明，农田土壤中RubisCO活性、cbbL基因丰度在0～1cm表层较高，并且认为光照是光能自养型固碳微生物重要的影响因素.本研究表明，两种土壤中Bradyrhizobium、Azoarcus和Methylibium属均为化能自养型固碳微生物，这些固碳菌占全部克隆的41.07%、12.65%和8.04%，是免耕水稻土中的优势微生物类群.化能自养微生物能够利用还原态的无机物，如铵盐、亚硝酸、硫、硫化氢、氢和亚铁化合物作为能源，在非表层土壤中由于光照难以到达，它们成为固碳微生物的主要能源物质.因此，对不同土壤环境中还原态无机物与化能自养微生物之间关系的研究，对于理解化能自养微生物的地理分布、生态功能和环境效应有重要的理论价值.

4 结论

采用13C-DNA-SIP技术，结合PCR-RFLP方法，以cbbLR为标记基因研究了我国南方免耕水稻土中自养固碳微生物的丰度和多样性.研究表明，免耕水稻土中存在高度多样性的自养固碳微生物，化能营养型Bradyrhizobium、Azoarcus和Methylibium是该土壤环境的主要固碳微生物类群；添加较高浓度的CO2能够提高免耕水稻土中二氧化碳固定自养微生物的多样性，表明在CO2升高环境条件下土壤中固定CO2微生物对大气CO2浓度具有一定的调节功能，有减缓CO2温室气体效应的潜力.

［1］Kiehl J T， Trenberth K E. Earth's annual global mean energy budget ［J］. Bulletin of the American Meteorological Society，1997，78（2）:197-208.

［2］Nakicenovic N， Alcamo J， Davis G， et al. Special report on emissions scenarios， working group III， Intergovernmental Panel on Climate Change （IPCC） ［J］. Cambridge University Press，Cambridge， ISBN 0， 2000，521（80493）:595.

［3］Hansen J E， Lacis A A. Sun and dust versus greenhouse gases: An assessment of their relative roles in global climate change ［J］. Nature， 1990，346:713-719.

［4］Melillo J M， Steudler P A， Aber J D， et al. Soil warming and carbon-cycle feedbacks to the climate system ［J］. Science，2002，298（5601）:2173-2176.

［5］Thauer R K. A fifth pathway of carbon fixation ［J］. Science，2007，318（5857）:1732-1733.

［6］Tolli J， King G M. Diversity and structure of bacterial chemolithotrophic communities in pine forest and agroecosystem soils ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2005，71（12）:8411-8418.

［7］Yuan H， Ge T， Wu X， et al. Long-term field fertilization alters the diversity of autotrophic bacteria based on the ribulose-1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase （RubisCO） large-subunit genes in paddy soil ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2012，95（4）:1061-1071.

［8］Selesi D， Pattis I， Schmid M， et al. Quantification of bacterial RubisCO genes in soils by cbbL targeted real-time PCR ［J］. Journal of Microbiological Methods， 2007，69（3）:497-503.

［9］刘 艳，陈书涛，刘 燕，等.增温对农田土壤碳氮循环关键过程的影响 ［J］. 中国环境科学， 2013，33（4）:674-679.

［10］郭树芳，齐玉春，董云社，等.滴灌对农田土壤CO2和N2O产生与排放的影响研究进展 ［J］. 中国环境科学， 2014，34（11）:2757-2763.

［11］Miltner A， Kopinke F D， Kindler R， et al. Non-phototrophic CO2fixation by soil microorganisms ［J］. Plant and Soil， 2005，269（1/2）: 193-203.

［12］Yuan H Z， Ge T D， Chen C Y， et al. Significant role for microbial autotrophy in the sequestration of soil carbon ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2012，78（7）:2328-233.

［13］Miltner A， Richnow H H， Kopinke F D， et al. Assimilation of CO2by soil microorganisms and transformation into soil organic matter ［J］. Organic Geochemistry， 2004，35（9）:1015-1024.

［14］Benson A A， Bassham J A， Calvin M， et al. The path of carbon in photosynthesis. V. Paper chromatography and radioautography of the products1 ［J］. Journal of the American Chemical Society，1950，72（4）:1710-1718.

［15］Tabita F R. Microbial ribulose 1， 5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase: a different perspective ［J］. Photosynthesis Research，1999，60（1）:1-28.

［16］Watson G M F， Tabita F R. Microbial ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation ［J］. FEMS Microbiology Letters，1997，146（1）:13-22.

［17］Nanba K， King G M， Dunfield K. Analysis of facultative lithotroph distribution and diversity on volcanic deposits by use of the large subunit of ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2004，70（4）:2245-2253.

［18］Elsaied H， Naganuma T. Phylogenetic diversity of ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large-subunit genes from deep-sea microorganisms ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2001，67（4）:1751-1765.

［19］Fan F L， Yin C， Tang Y J et al. Probing potential microbial coupling of carbon and nitrogen cycling during decomposition of maize residue by13C-DNA-SIP ［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2014，70:12-21.

［20］Zhang L M， Hu H W， Shen J P， et al. Ammonia-oxidizing archaea have more important role than ammonia-oxidizing bacteria in ammonia oxidation of strongly acidic soils ［J］. The ISME Journal，2012，6（5）:1032-1045.

［21］Kisselle K W， Garrett C J， Fu S， et al. Budgets for root-derived C and litter-derived C: comparison between conventional tillage and no tillage soils ［J］. Soil Biology and Biochemistry， 2001，33（7）:1067-1075.

［22］Liebig M A， Morgan J A， Reeder J D， et al. Greenhouse gas contributions and mitigation potential of agricultural practices in northwestern USA and western Canada ［J］. Soil and Tillage Research， 2005，83（1）:25-52.

［23］高云超，朱文珊.秸秆覆盖免耕土壤微生物生物量与养分转化的研究 ［J］. 中国农业科学， 1994，27（6）:41-49.

［24］Selesi D， Schmid M， Hartmann A. Diversity of green-like and red-like ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase largesubunit genes （cbbL） in differently managed agricultural soils ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2005，71（1）:175-184.

［25］Lueders T， Manefield M， Friedrich M W. Enhanced sensitivity of DNA-and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients ［J］. Environmental Microbiology， 2004，6（1）:73-78.

［26］吴小红，简 燕，陈晓娟，等.自养微生物同化C02的分子生态研究及同化碳在土壤中的转化 ［J］. 生态学报， 2014，34（3）:701-709.

［27］Cannon G C， Bradburne C E， Aldrich H C， et al. Microcompartments in prokaryotes: carboxysomes and related polyhedra ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2001，67（12）:5351-5361.

［28］Yuan H， Ge T， Wu X， et al. Long-term field fertilization alters the diversity of autotrophic bacteria based on the ribulose-1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase （RubisCO） large-subunit genes in paddy soil ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2012，95（4）:1061-1071.

［29］Wu X， Ge T， Wang W， et al. Cropping systems modulate the rate and magnitude of soil microbial autotrophic CO2fixation in soil［J］. Frontiers in Microbiology， 2015，6:379.

［30］袁红朝，秦红灵，刘守龙，等.长期施肥对稻田土壤固碳功能菌群落结构和数量的影响 ［J］. 生态学报， 2012，32（1）:183-189.

［31］Wu X H， Ge T D， Yuan H Z， et al. Changes in bacterial CO2fixation with depth in agricultural soils ［J］. Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2014，98（5）:2309-2319.

Diversities of autotrophic CO2-fixing microbes in no-tillage paddy soils.

QI
AN Ming-mei， XIAO Yong-liang， PENG Wen-tao， CAO Hui*（Key Laboratory of Microbiological Engineering of Agricultural Environment， Ministry of Agriculture， College of Life Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3754～3761

The aim of the study was to investigate the diversity and community structure of autotrophic carbon dioxide-fixing bacteria by DNA-based stable isotope probing （DNA-SIP） technology and microcosm model method in no-till paddy soil in South China. The total DNAs by CsCl density-gradient centrifugation were separated on the basis of the buoyant density distinguishing after an 80-day incubation as templates， it showed that the carbon dioxide-fixing autotrophic microbes can assimilate and utilize carbon dioxide in soil. The RFLP-PCR showed that the highest copies of the cbbLR gene from two kinds of soil samples were 1.36×105copies/g dry soil and 2.21×105copies/g dry soil，respectively. The structure of carbon dioxide-fixing autotrophic microbial communities were significantly different from each other by clone library and phylogenesis analysis. Bradyrhizobium and Rubrivivax were the main microorganisms in soil FG and accounted for 60.40% and 13.86% of all clones， respectively. The community composition of carbon dioxide-fixing bacteria in soil TF was relatively uniform， and Rhodopseudomonas， Bradyrhizobium， Methylibium and Variovorax accounted for 20.92%， 11.94%， 16.42% and 10.45% of the total clones， respectively. The number of OTUs and diversity index of13C-carbon dioxide stable isotope labeled cbbLR library were higher than these of the12C-carbon dioxide labelled control library， and the community structure also showed significant differences. Together， we conclude that there are diverse autotrophic bacteria capable of fixing carbon dioxide in the no-tillage paddy soil， and they have an important role in the carbon cycling for farmland soils.

carbon dioxide-fixing microbes；no-tillage paddy soil；cbbLR gene；DNA-SIP；PCR-RFLP analysis

X172，Q938

A

1000-6923（2015）12-3754-08

钱明媚（1989-），女，江苏连云港人，南京农业大学生命科学学院硕士研究生，主要从事环境微生物研究.

2015-05

国家自然科学基金项目（41371262，40871125）

* 责任作者， 教授， hcao@njau.edu.cn