李 蓉,冯 锋,*,陈泽忠,白云峰,郭芳芳,吴芳英,周 高

（1.山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同037009;2.南昌大学化学学院，江西南昌330047）

基于磁性微球的免疫荧光法对癌胚抗原的检测

李 蓉2,冯 锋1,2*,陈泽忠1,白云峰1,郭芳芳1,吴芳英2,周 高2

（1.山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同037009;2.南昌大学化学学院，江西南昌330047）

采用双夹心磁性微球免疫荧光显微法对样品中的癌胚抗原进行分离与检测。首先用EDC/NHS对磁性微球表面的羧基进行活化后偶联抗癌胚抗原单克隆抗体mAbCEA-C3制成免疫磁珠，再对样品中的CEA进行捕获，并进行免疫标记，最后用荧光显微镜进行检测。考察洗涤次数和免疫时间等因素对实验的影响，在最优条件下对CEA进行检测，结果表明：随着CEA浓度的增加荧光强度逐渐增强，检测限为9.67 ng/mL，可实现对CEA的定性和半定量测定。该方法操作简单快捷，样品用量少，选择性好，可应用于临床检验。

磁性微球；免疫荧光；癌胚抗原

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是一种广泛应用于胃肠道、乳腺癌和肺癌的肿瘤标志物，其分子量约为180 kDa[1]。CEA在正常人体内的含量约为2.5 ng/mL，在吸烟者体内的含量约为5.0 ng/mL[2]。当人体内的组织发生病变或癌变时，CEA的浓度就会升高。因此，建立一种简单、灵敏、快速、准确的CEA检测方法对肿瘤的鉴别诊断、病情检测及疗效评价等方面有重要的临床价值。

目前检测CEA的方法主要有电化学法[3-5]、荧光免疫法[6-8]、酶联免疫法[9]、化学发光法[10-12]。这些方法存在一些缺点，如前处理复杂、需要标记、检测时间较长等。免疫磁珠既具有免疫分析的高特异性又具有磁性纳米微球的超顺磁性，分离过程高保真等优点，将免疫磁珠和免疫荧光分析结合在一起，分离过程消耗时间少，效率高，把分离和富集结合在一起，对样品的生物活性损耗几乎可以忽略，实验操作简单，灵敏度高，不需要昂贵的外用仪器，被广泛应用于各个领域[13-15]，在肿瘤标志物检测中已有应用[16]。本文中使用羧基磁性微球为固相载体，通过EDC/NHS活化羧基偶联抗体制成免疫磁珠，对CEA进行捕获，使用bio-mAbCEA进行夹心，使用Avidin-FITC进行荧光标记，将磁珠免疫复合物制片放于正置荧光显微镜下进行观察，对CEA进行了定性和半定量检测，从而建立了一种结合磁性微球和免疫荧光的新型肿瘤标志物分析方法。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

正置荧光显微镜（BX63）(奥林巴斯，日本)，漩涡振荡器（IKA lab dancer，德国），溶剂过滤器及0.22 μm（水系）微孔滤膜购于天津市东康科技有限公司，超顺磁性聚合物纳米微球（羧基修饰，750 nm）、磁分离架购于上海奥润微纳新材料科技有限公司，气浴恒温振荡器购于上海乔跃电子有限公司，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、N-乙基-N-（二甲氨基丙基）碳二亚胺(NEthyl-N'-(dimethyaminopropyl)-carbodiimide，EDC)购于Sigma公司，牛血清蛋白（BSA）、2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）购于阿拉丁，癌胚抗原(CEA)标准品、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异性抗原（PSA）购自郑州博赛生物技术有限公司，mAbCEA-C3、mAbCEAB5、bio-mAbCEA-B5、异硫氰酸荧光素修饰的亲和素（Avidin-FITC）购自北京博奥森生物技术有限公司。其余所有试剂均为分析纯，实验所用水为二次蒸馏水。

1.2 免疫磁球的制备

免疫磁球制备原理如图1所示，使用EDC/NHS法，在磁珠表面偶联特异性抗体。

EDC/NHS活化磁珠：①取50μLL PM3-050磁珠于500μLL离心管中，用200μLMES/T（10 mmol/L pH 5.0）洗涤2次，磁分离后移除上清；②向其中加入新配制的EDC,NHS溶液各100μL，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，在气浴恒温振荡器中37℃活化30 min。③磁分离移除上清，加入200 μLMES/T（10 mmol/L pH 5.0）洗涤2次，磁分离后移除上清。

mAbCEA-C3的共价偶联：①加入50μLmg mAbCEA-C3于上述活化的磁珠中，用PB溶液调节总体积至200μL，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，在气浴恒温振荡器中37℃活化3 h。②磁分离移除上清，加入200 μLPBS/T（10 mmol/L pH 7.4）洗涤2次，加入500 μLPBS/T(pH 7.4,含1%BSA)使磁珠重新处于悬浮状态，将气浴恒温振荡器中温度调为37℃，振荡封闭1 h，磁珠在该期间保持悬浮状态。③磁分离移除上清，加入200μLPBS/T（10 mmol/L pH 7.4）洗涤4次，磁珠用500 μLPBS/T(pH 7.4,含0.5%BSA、0.02%NaN3)使之重新处于悬浮状态，放于4℃的冰箱中保存。

图1 羧基磁球与抗体的偶联示意图

1.3 夹心荧光免疫分析法对CEA的检测

CEA的检测的流程如图2所示。具体操作步骤为：①取若干支500μL的离心管，向其中加入500 μLPBS(pH 7.4，含1%BSA)溶液，在气浴恒温振荡器中37℃振荡1 h，然后使用PBS/T(10 mmol/L，pH 7.4)洗涤3次，用氮气吹干备用；②在包被好的离心管中分别加入15μL4.2.2中制备的免疫磁珠，使用100μLPBS/T溶液洗涤2次，磁分离，弃上清；③分别向每支离心管中加入15μL不同浓度的CEA溶液，使用PBS定容至100μL，在恒温振荡器中37℃振荡45 min；④磁分离，100μL PBS/T洗涤3次，弃去上清液，加入15μL浓度为 1.5 μg/mL bio-mAbCEA-B5，在恒温振荡器中37℃振荡45 min；⑤磁分离，100μLPBS/T洗涤3次，弃去上清液，加入15μL浓度为1.5 μg/mL Avidin-FITC，气浴恒温振荡器中37℃振荡45 min；⑥磁分离，100μLPBS/T洗涤3次，将上清液去除，使之重新悬浮于30μLPBS中，取10μL免疫复合微球滴在载玻片上，加入5μL荧光抗猝灭剂，盖上盖玻片，制片，在正置荧光显微镜下使用100×油镜进行荧光检测，曝光时间设为800 ms，照片采集、曝光时间一致。

1.4 选择性实验

为了验证方法的特异性，在相同的条件下，使用AFP和PSA替代CEA进行1.3中的检测，并记录结果，其中PSA,AFP的浓度远大于CEA的浓度,为1μg/mL。

图2 荧光免疫分析示意图

2 结果与讨论

2.1 免疫结合时间选择

改变1.3的实验步骤中的免疫结合时间，对浓度为300 ng/mL的CEA进行处理，在正置显微镜下观察，拍照，使用Image-Pro®Plus 7.0分析其线性荧光强度，不同免疫结合时间对免疫磁球复合物在正置荧光显微镜下的线性荧光强度影响如图3所示。从图3中可以看出，免疫结合时间在10～90 min时，线性荧光强度随时间延长增大，当结合时间为45 min时，磁珠免疫复合物形成效率相对最高，45～90 min之间线性荧光强度趋于平缓。原因是免疫结合时间过短，抗原抗体之间结合不充分，结合的稳定程度还不高，在实验中反复的洗涤、分离，因而效率较低，因此，我们选择免疫结合实际时间为45 min。

图3 免疫结合时间对磁球免疫复合物荧光强度的影响

2.2 洗涤次数对阴性对照的影响

在阴性对照组中，使用PBS/T在洗涤的次数对最后的检测具有很重要的影响。洗涤次数过少，容易造成假阳性，故在本实验中考查了洗涤次数对检测的影响，实验结果如图4所示，洗涤次数过少，由于bio-mAbCEA-B5与Avidin-FITC结合形成的复合物非特异性的吸附到免疫磁珠上形成假阳性。随着洗涤次数的增加，空白对照的荧光强度逐渐减弱，当洗涤3次时，制片测得的荧光强度可以忽略，为节省时间，实验中选择使用PBS/T洗涤3次。

图4 洗涤次数对阴性对照的影响

2.3 荧光显微检测与荧光强度分析

在本实验中，我们使用Image-Pro®Plus 7.0和Sigmaplot 12.0软件获取和分析荧光免疫分析的数据。分析结果如图5所示，CEA浓度为300,200,50 ng/mL时捕获的荧光微球照片如图A,B,C所示，使用Image-Pro®Plus 7.0软件对其线性荧光强度进行分析，波峰和波谷分别代表微球和背景的荧光强度，分析结果如图a,b,c所示，由图6看出随CEA浓度增大，线性荧光强度增强，且各浓度荧光强度之间存在差异，对照荧光强度较弱或基本无荧光。荧光强度与CEA浓度在25～300 ng/mL之间线性关系良好，不胜数线性方程为Y=0.7153X+21.5659，检测限为9.67 ng/mL。

A,B,C对应CEA浓度分别为300,200,50 ng/mL，a,b,c是对应的Image-Pro®Plus 7.0线性荧光强度分析结果

图5 免疫复合物的荧光照片

图6 正置荧光显微镜检测免疫磁球复合物的线性荧光强度与CEA浓度关系图

2.4 选择性实验

在同样的条件参数下，按1.3的实验步骤对AFP,PSA进行同样的处理，制片，在正置荧光显微镜下进行观察，荧光较弱，基本可以忽略，说明此磁球荧光免疫分析具有较好的特异性，选择性良好。

3 结论

本实验采用免疫荧光法结合免疫微球对CEA进行分离检测。首先在磁性微球上通过EDC/NHS对抗体进行偶联，制成免疫磁珠对样品中的CEA进行捕获，在使用免疫荧光法时，洗涤次数对检测的假阳性影响很大，我们考察了洗涤次数和免疫时间的影响，最后选择洗涤3次，免疫反应时间为45 min，在最优条件下对CEA进行检测，样品消耗量仅为15μL，发现随着CEA浓度的增加荧光强度逐渐增强，检测限为9.67 ng/mL，实现了对CEA的定性和半定量分析，实现了对CEA快速高效检测，与传统分析方法相比较，此法操作简单，所需仪器简单，样品用量少，选择性好，有望应用于临床检验。

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Determination of Carcinoembryonic Antigen Based on Magnetic Microsphere Assited Fluoroimmunoassay

LI Rong2,FENG Feng1,2,*,CHEN Ze-zhong1,BAI Yun-feng1,GUO Fang-fang1,WU Fang-ying2,ZHOU Gao2
(1.College of Chemistry and Environmental Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi 037009;2.School of Chemistry,Nanchang University,Nanchang Jiangxi,330047)

A novel immunoassay for the determination of CEA was established by combining a fluoroimmunoassay and immunomagnetic separation.Carboxyl groups on the magnetic beads were first activated with a mixture of EDC and NHS to give reactive succinimide esters.The mAbCEA-C3 was then passed over the surface and esters react spontaneously with amino groups to link mAbCEAC3 covalently to magnetic beads to form Immonumagnetic beads(IBMs).In the mixture samples,CEA was captured by mAbCEA-C3 with high specificity and affinity.The conditions,such as washing times and immune reaction time were optimized.The final choice of immune time is 45min,three times of washing.The results indicated that the fluorescence intensity increased with the increment of CEA concentration in the optimal condition.The LOD is 9.67 ng/mL.Qualitative and semiquantitative detection of CEA was conducted based on the combination of IBMs with fluoroimmunoassay.The method is simple and sensitive and could be a possible application for the detection of CEA in clinical diagnostics.

magnetic microspheres;fluoroimmunoassay;carcinoembryonic antigen

73-3

A

1674-0874(2015)04-0033-05

2015-05-15

李蓉(1988-),女，湖北恩施人，在读硕士，研究方向：SPR生物传感器。∗冯锋，男，博士，教授，通信作者。

〔责任编辑 杨德兵〕