何东，冼燕萍，严婉盈，郭新东，叶梅，万渝平

（1.嘉应学院梅州师范分院，广东梅州514087；2.广州质量监督检测研究院，广东广州510110；3.成都市食品药品检验研究院，四川成都610000）

DLLME-UPLC-MS/MS法测定食用油中的双酚类化合物

何东1，冼燕萍2，严婉盈2，郭新东2，叶梅3，万渝平3

（1.嘉应学院梅州师范分院，广东梅州514087；2.广州质量监督检测研究院，广东广州510110；3.成都市食品药品检验研究院，四川成都610000）

基于分散液液微萃取（DLLME）技术和同位素稀释-超高效液相色谱-质谱/质谱（ID-UPLC-MS/MS），建立了一种快速测定食用油中7种双酚类化合物的方法。优化了萃取剂种类及体积、涡旋分散时间等影响萃取的关键因素；优化了UPLC分离条件和质谱定性定量参数。优化条件为：400 μL甲醇/乙腈（1∶1，v/v）混合溶液作为萃取剂，涡旋分散萃取1 min；以C18色谱柱和甲醇-0.05%氨水梯度洗脱分离，质谱多反应监测模式（MRM）测定。结果表明，7种双酚类化合物在0.5 μg/L～500 μg/L内线性关系良好，相关系数均在大于0.998，方法定量限（S/N=10）在0.2 μg/L～3.0 μg/kg之间，3个添加水平的平均回收率为80.1%～93.7%，相对标准偏差（n=6）为4.4%～9.1%。本方法前处理简单，节省溶剂和时间，准确灵敏，适用于食用油中7种双酚类化合物的检测。

分散液液微萃取；超高效液相色谱-质谱/质谱；食用油；双酚类化合物

双酚类化合物（Bisphenols，BPs）是一类具有两个羟苯基结构的物质。这类化合物化学性质稳定、耐高温，延展性良好，生产成本低廉，是生产聚碳酸酯等多种高分子材料的重要原料，被广泛应用于食品包装材料等工业生产中［1］。但是，此类化合物对人体具有内分泌干扰效应，影响生殖与发育机能，并具有致畸、致癌和致突变等毒效应，而且易富集，不易降解，对人类健康和生态环境均有潜在的危害［2-4］。欧盟规定，婴幼儿奶瓶中禁止使用双酚A（Bisphenol A，BPA）；与食品接触塑料制品中，BPA和双酚S（Bisphenol S，BPS）的迁移量应分别小于0.6 mg/kg和0.05 mg/kg；而双酚F（Bisphenol F，BPF）则为禁用［5］。我国也有类似的规定［6］，然而，现有研究表明这类物质在食品中广泛存在［7-9］。因此，建立双酚类化合物的检测方法对保护环境和消费者健康具有重要意义。

双酚类化合物的检测方法主要有液相色谱法（LC）［10-12］、气相色谱-质谱法（GC-MS）［13-14］和液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）［15-19］。鉴于LC法灵敏度低、GC-MS法需要衍生处理，而LC-MS/MS法选择性和抗干扰能力强、灵敏度高、定性定量准确，广泛用于痕量有害物质的检测，也是双酚类物质目前主要的检测方法。但是，现有研究多为对四溴双酚A（Tetrabromobisphenol A，TBBPA）、BPA、BPF及其缩水甘油醚等衍生物的检测，但尚未见食用油中BPS等多种双酚类化合物同时测定方法报道。分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）是2006年Assadi等［20］提出的一种集萃取和富集于一体的前处理技术，具有操作简单、快速、耗有机溶剂少、成本低和对环境友好等优点，已被广泛应用于环境、食品样品中痕量有机污染物的分析。因此，本研究采用DLLME技术，优化萃取剂的种类和体积及涡旋分散萃取时间等影响萃取的关键因素，结合同位素稀释技术和超高效液相色谱-质谱/质谱仪（UPLC-MS/MS），优化色谱分离条件和质谱定性定量参数，建立了食用油中BPS、BPA、BPF、TBBPA、双酚B（Bisphenol B，BPB）、双酚C（Bisphenol C，BPC）和双酚AF（Bisphenol AF，BPAF）7种双酚类化合物的检测方法。方法简单、快速、准确、成本低，可为食用油中双酚类化合物的检测及监控提供技术参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱和XevoTMTQ三重四极杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS，美国Waters公司）；MS3 basic漩涡混合器：德国IKA公司；台式离心机：科大中佳公司；Milli-Q去离子水发生器：美国Millipore公司。

标准品：BPA、BPF和TBBPA（纯度均大于99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司），BPS（纯度大于99%，美国Admas公司），BPB、BPC和BPAF（纯度均大于95%，日本TCI公司）；同位素内标：BPA-d14（纯度大于98%，美国Sigma-Aldrich公司），BPF-d10（纯度大于99%，日本东京化工公司），BPS-13C12（纯度大于99%，加拿大化学研究公司），TBBPA-d10（100 mg/L，上海市化工研究院）。甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯，美国Fisher公司；氨水为分析纯，广州化学试剂厂；去离子水（18.0 MΩ·cm），由Milli-Q制得。

1.2标准溶液配制

分别称取适量的7种双酚类物质标准品，用甲醇配成质量浓度均为100 mg/L的单标贮备液；分别吸取适量7种单标贮备液，用甲醇稀释成混合标准溶液，其中BPS和BPAF的质量浓度为1.0 mg/L，其余5种化合物的质量浓度均为10.0 mg/L。

分别称取适量的3种同位素标准品，用甲醇配成质量浓度均为50 mg/L的内标贮备液；采用逐级稀释法，用甲醇将4种内标配成混合内标工作溶液，其中BPS-13C12的质量浓度为0.02 mg/L，其余3种同位素内标的质量浓度均为0.2 mg/L。

用甲醇配制系列浓度混合标准工作溶液，其中BPS和BPAF的浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/L，其余5种化合物的浓度分别为5.0、10.0、50.0、100、500 μg/L，BPS-13C12的浓度均为5.0 μg/L，其余3种同位素内标的浓度均为50.0 μg/L。

1.3样品处理

称取1.0 g食用油样品于10 mL尖底玻璃离心管中，加入3mL正己烷分散稀释，再加入50 μL混合内标工作溶液，涡旋混匀，然后快速注射入400 μL甲醇/乙腈（1∶1，v/v）混合溶液，涡旋分散萃取1min，2500 r/min离心5 min，用微量注射器将离心管底部的沉积相［体积约为（200±10）μL］转移入400 μL尖底玻璃内插管中，待UPLC-MS/MS测定。

1.4UPLC-MS/MS测定条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.05%（v/v，下同）氨水溶液；梯度洗脱程序：0.0～1.0 min，50%A；1.0 min～6.0 min，50%A～80%A；6.0 min～6.5min，80%A～100%A；6.5min～7.5min，100%；7.5 min～7.6 min，100%A～50%A，平衡2 min；流速：0.25 mL/min；柱温30℃；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）电离，负离子模式扫描，多反应监测（MRM）模式检测；毛细管电压1.0 kV；离子源温度150℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流速800 L/h；锥孔气流速50 L/h；碰撞气为氩气，0.2 mL/min；化合物的监测离子对（m/z）、锥孔电压等质谱参数见表1。

表17　种待测物及同位素内标物的质谱参数Table 1MS parameters of studied compounds

2结果与讨论

2.1萃取剂种类和体积

在DLLME中，选择合适的萃取剂和体积是获得较高萃取富集效率的关键因素。萃取剂的性质影响三相平衡体系的形成，故要求萃取剂对目标物具有一定的溶解度，与样品不互溶，密度大于被萃取体系，且色谱行为不影响目标物的分析。基于上述要求，本研究比较了甲醇、乙腈、甲醇/乙腈（7∶3，v/v）、甲醇/乙腈（1∶1，v/v）、甲醇/乙腈（3∶7，v/v）5种溶剂作为萃取剂的萃取效率，如图1所示。

图1　不同萃取剂的萃取回收率Fig.1Extraction recoveries of 7 bisphenols in different extractants

实验结果表明：甲醇/乙腈（1∶1，v/v）的整体萃取效率最好，原因可能为混合溶剂的极性和诱导性发生改变而协同导致，不同混合比例的结果稍有差异。因此，实验选择甲醇/乙腈（1∶1，v/v）作为萃取剂。

对萃取剂体积的要求为：可以获得较高的富集倍数，以提高方法灵敏度；同时能够满足进样体积的要求。实验考察了不同萃取剂体积（300、400、500、600、700、800 μL）的情况。实验结果表明，当萃取剂体积为300 μL时，离心得到的沉淀相过小，难以移取；萃取剂体积为400 μL～800 μL时，萃取回收率整体变化不明显（如图2所示）。

图2　萃取剂体积对萃取回收率的影响Fig.2Effect of extraction volume on the extraction recoveries of 7 bisphenols

但沉淀相体积逐渐增大，约由（200±10）μL增至（450±10）μL，富集倍数则相应减少，方法的灵敏度也随之降低，当萃取剂体积为400 μL时，方法灵敏度和进样体积均能较好满足需要。因此，本实验确定萃取剂体积为400 μL。

2.2分散萃取时间

在DLLME中，常借助加入分散剂、涡旋或超声等手段将萃取剂以微小液滴的形式分散在样品溶液中，形成稳定的乳浊体系，快速完成目标化合物在样品与萃取剂之间的分配平衡。在本实验中，由于食用油的粘度较大，在加入萃取剂前，先用正己烷稀释，增加样品的流动性，并选用涡旋分散的方式实现分散液液微萃取。

对比了正己烷用量分别为2、3、4、5mL时的萃取情况，实验发现当正己烷用量为2mL时，食用油样品的粘度仍偏大，萃取效果不理想；当正己烷用量为3 mL～5 mL时，食用油样品的黏度逐渐降低，但萃取效果无明显差异。所以实验选择正己烷用量为3 mL。

考察了涡旋分散萃取时间分别为0.5、1、2、3 min时的萃取回收率情况。结果表明，在0.5 min～1 min，萃取回收率随着萃取时间的增加逐渐提高；在1 min～3 min，萃取回收率基本平衡。因而选择涡旋分散萃取时间为1 min。

2.3色谱质谱条件

7种双酚类物质及4种同位素内标物的分子结构均含有酚羟基，易在ESI源的负离子模式下获得较高丰度的［M-H］-准分子离子峰。对确定的母离子进行二级质谱扫描，并根据欧盟2002/657/EC指令，每种待测化合物选择2个主要特征碎片离子作为定性与定量离子；同位素内标物则选择1个主要特征碎片离子。然后对碰撞电压进行优化，使特征碎片离子的强度达到最大。7种双酚类物质和内标物的特征离子对和电离条件、碰撞条件见表1。

双酚类物质的色谱分离常用C18色谱柱。本实验采用BEH C18色谱柱，对比了甲醇-水、甲醇-0.05%氨水和乙腈-0.05%氨水流动相体系的分离效果。结果表明，甲醇-0.05%氨水的效果最好，原因为：流动相加入氨水促进了目标化合物的离子化效率，提高响应灵敏度，同时可以消减实际样品检测时产生的基质抑制效应；而甲醇的洗脱能力较乙腈弱，可以获得更好的分离效果。因此，本实验选择甲醇-0.05%氨水为流动相，并优化了2.4所述的梯度洗脱程序，使各目标化合物获得良好的分离和灵敏度，并尽量避免与样液中的杂质共流出，降低基质效应。7种双酚类化合物的总离子流色谱图如图3所示。

图3　7种双酚类化合物的总离子流色谱图Fig.3Total ion chromatograms of 7 bisphenols

2.4线性方程及检出限

本实验采用同位素内标进行定量，可以有效校准基质效应，提高定量的准确性。按照本实验条件测定2.2配制的系列混合标准工作溶液，7种双酚类化合物以其定量离子峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，以相应的浓度为横坐标进行回归分析，线性范围和相关系数见表2，可见，相关系数均大于0.998，表明7种双酚类化合物在0.5 μg/L～500 μg/L范围内线性关系良好；分别以3倍信噪比（S/N）、10倍信噪比（S/N）结合前处理浓缩倍数（5倍）和回收率情况，估算得到7种双酚类化合物的方法检出限（LODs）和定量限（LOQs），如表2所示，方法定量限在0.2 μg/L～3.0 μg/kg之间，表明方法具有较高的灵敏度。

表2　7种双酚类化合物的线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 2Linear range，LODs and LOQs of 7 BPs

2.5回收率、精密度试验

选取阴性食用油样品按照本实验方法进行3个浓度水平（1×LOQ、2×LOQ和10×LOQ）的添加回收和精密度实验（n=6）。实验结果见表3。

表3　回收率和精密度测定结果（n=6）Table 3Recoveries and repeatability for 7 BPs（n=6）

7种待测物的平均回收率在80.1%～93.7%之间，相对标准偏差（RSD）在4.4%～9.1%之间，表明方法回收率和精密度良好。

2.6实际样品检测

采用本方法测定了市售的花生油、大豆油和调和油等10个食用油样品，均未检出7种目标化合物。

3结论

基于DLLME和同位素稀释技术，结合UPLC-MS/ MS，建立了一种快速测定食用油中双酚类化合物的方法。每个样品仅需加入3 mL正己烷和400 μL甲醇-乙腈混合萃取剂，萃取时间为1 min，前处理简单，有机溶剂消耗少，节省了浓缩的时间；萃取液经C18色谱柱和甲醇-0.05%氨水梯度洗脱分离，质谱MRM测定，同位素内标法定量，有效消减了基质效应，方法定性定量准确；7种双酚类化合物的方法定量限（S/N=10）为0.2 μg/kg～3.0 μg/kg，灵敏度高。所建立的检测方法成本低、效率高，准确灵敏，精密度良好，能够满足不同食用油中双酚类化合物的检测需求。

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Rapid Determination of Seven Bisphenols in Edible Oils with Dispersive Liquid-Liquid Microextraction and Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HE Dong1，XIAN Yan-ping2，YAN Wan-ying2，GUO Xin-dong2，YE Mei3，WAN Yu-ping3
（（1.Meizhou Teachers'Academy，Jiaying University，Meizhou 514087，Guangdong，China；2.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510110，Guangdong，China；3.Chengdu Food and Drug Inspection Institute，Chengdu，610000，Sichuan，China）

A simple and rapid method for determination of seven bisphenols in edible oils using dispersive liquid-liquid microextraction（DLLME）and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with isotope dilution（ID-UPLC-MS/MS）was developed.In the paper，related critical factors that may influence extraction efficiency，such as the type and volume of extraction solvent and vortex-assisted dispersive extraction time，and the separation condition of UPLC，qualitative and quantitative parameters of mass spectrometry were investigated and optimized.The optimum extraction condition was：extracting agent was 400 μL mixed solution（methanol：acetonitrile=1∶1，v/v），and vortex extraction 1 min.Targets were separated with a C18 chromatographic column by gradient elution with methanol-0.05%ammonia，and determined by UPLC-MS/MS under ESI at negative and multiple reaction monitoring（MRM）mode.The results indicated that 7 bisphenols were in the range of 0.5 μg/L-500 μg/L with the correlation coefficients greater than 0.998，the method quantitation limit（LOQ，S/N=10）of the analytes were ranged from 0.2 μg/kg to 3.0 μg/kg.The average recoveries were from 80.1%to 93.7%，and the relative standard deviation（RSD，n=6）were in a range of 4.4%-9.1%when three levels of standard were spiked into edible oil sample.The method was simple，fast，saving solvent and time，accurate and senstive，which was suitable for the detection of 7 bisphenols in edible oils.

Dispersive liquid-liquid microextraction；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；edible oils；bisphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.029

2015-03-31

何东（1968—），男（汉），讲师，本科，研究方向：化学分析方法。