付苗苗

（河南工业贸易职业学院，河南郑州450012）

面包中丙烯酰胺分析方法改进研究

付苗苗

（河南工业贸易职业学院，河南郑州450012）

面包经过高温烘烤会产生危害人体健康的丙烯酰胺。本文针对面包中丙烯酰胺分析方法的改进进行研究，建立一套简单实用的丙烯酰胺检测方法，希望为研究抑制食品中丙烯酰胺的产生提供依据，从而对于提高焙烤食品的安全性，降低消费者健康风险，起到积极意义。

面包；丙烯酰胺；分析方法

2002年4月，瑞典国家食品管理局研究证实，淀粉类食物经过煎炸烤等高温烹调加工，会产生对人体危害人体健康的有机化合物丙烯酰胺［1］。更多的研究研究表明，丙烯酰胺可能具有生殖毒性和致畸性，还可引起遗传物质改变和癌症发生，其中最重要的毒性影响就是诱发癌症，并已被国际癌症研究机构列入2A类致癌物，即人类可能致癌物［2］。自发现高温食品中存在丙烯酰胺至今，丙烯酰胺的问题一直是食品安全热点之一。面包是世界各国居民饮食中重要的主食，是以小麦粉为主要原料，经过烘烤的方式加热而成的焙烤食品，因此，面包也面临着丙烯酰胺问题带来的影响。然而，由于面包中成分复杂，并且产生的丙烯酞胺含量相对较低，因此获得理想的丙烯酰胺检测方法成为首要解决的问题。目前食品中丙烯酰胺的检测方法主要采用气相色谱-质谱法（GC-MS）与液相色谱-质谱联用新技术（LC-MS/MS）。GC-MS法灵敏度（5 μg/kg～10 μg/kg）、专一性均好，但是样品的分离、提取、净化方法与溴化加成反应等预处理较麻烦。LC-Ms/Ms法灵敏度较好（20 μg/kg～50 μg/kg），且无需衍生化，因此比GC-MS法省事得多，但存在装置价格较高的缺点。而另一种色谱技术——离子排阻和离子交换色谱分析法，只在几篇文献中有报道［3］。在有关学者的研究分析中，离子色谱应用202 nm紫外检测成功检测了食品中的丙烯酰胺［4］。因此，只要有合适的色谱分离和有效的样品前处理，应用紫外检测器是能够分析食品中的痕量小分子丙烯酰胺的。

本文对面包中丙烯酰胺分析方法的改进进行研究，建立一套简单实用的丙烯酰胺检测方法，希望为抑制面包中丙烯酰胺产生的研究提供基础，从而对于提高焙烤食品的安全？性，降低消费者健康风险，起到积极意义。

1材料

1.1主要试剂

丙烯酰胺（标准品）：美国Sigma公司；面包专用粉：福建省晋江福源食品有限公司；人造奶油：福建省晋江福源食品有限公司；甲醇（色谱纯）：韩国SK化学公司；乙腈（色谱纯）：韩国SK化学公司；正己烷（分析纯）、六氰合铁（Ⅲ）化钾（分析纯）、硫酸锌（分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司；甲酸（色谱纯）：天津康科德科技有限公司。

1.2主要仪器

868型酸度计：美国奥立龙公司；2000D型超纯水器：北京长风仪器仪表公司；VDRTEX－5型旋涡混合器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Waters 2695 LC：美国waters公司；TGL-16G-A高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器公司；冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；氮吹仪：上海安普科技有限公司；旋转蒸发仪：北京德天佑科技有限公司；烤箱：捷嘉食品机械设备有限公司；揉面机：万杰食品机械有限公司；粉碎机：西贝乐有限公司。

2方法

2.1面包的制作

面包粉500 g，即发干酵母5 g，盐5 g，糖30 g，起酥油20 g，奶粉20 g，水按面团吸水量而定。工艺流程按一下流程操作。面粉及各种配料称重→混合搅打→基础醒发→称重、分割→整形→成型→醒发→烘烤→冷却→成品。结合实际加工过程，烘烤温度为150℃～190℃，烘烤时间为15 min～20 min。

2.2样品的准备

面包从烤箱中取出冷却1小时后，将面包皮用小刀进行剥离。每3个面包的面包皮进行混合，称重，冷冻储存。

2.3AA的测定

2.3.1标准溶液的配置

准确称取100 mg丙烯酰胺标准品溶于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，-20℃冰箱保存作为储备溶液。分别配制浓度为50、80、100、150、200、250 ng/mL和300 ng/mL的AA标准溶液。经0.45 μm的膜过滤，用Waters液相工作站绘制丙烯酰胺标准曲线。

2.3.2样品提取及净化

2 g粉碎样品称入25 mL离心管中。10 mL 75%甲醇水溶液，100 μL CarrezⅠ，100 μL CarrezⅡ，分别加入试管中。样品经摇床震荡提取45 min（25℃，100 r/min），10 000 r/min转速离心（10℃，10 min）。5 mL上清夜定量转移至玻璃试管中，在45℃下氮吹至1 mL。Oasis HLB固相萃取柱用5 mL甲醇，5 mL水平衡后用于纯化样品。浓缩的提取液完全通过萃取柱，再经2 mL10%（体积比）甲醇水溶液洗脱。收集洗脱液，经0.45 μm针孔滤膜过滤，准备用于液相分离。

2.3.3仪器条件及参数设置

HPLC条件：美国Waters2695高效液相系统，配有二极管阵列检测器，进样量20 μL，HC-75H+柱（305mm×7.75mm，Hamilton，NV，USA），流动相10mmol/L的甲酸水溶液，流速为0.6 mL/min，柱温50℃，紫外检测波长200 nm。

3结果与讨论

3.1丙烯酰胺的标准曲线

以质量浓度（ng/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1　丙烯酰胺标准工作曲线图Fig.1Standard curve of Acrylamide

3.2流速的确定

如图2，通过比较不同流速发现，流速增加，保留时间缩短，柱压升高，峰高有较小的改变。最终依据分离效果和合适的柱压将流速确定为0.6 mL/min。

图2　不同流速所得丙烯酰胺标准品色谱图Fig.2The standard color spectrum of different velocity of Acrylamide

3.3柱温的确定

如图3，对柱温的影响也进行了比较，随着柱温的升高，保留时间缩短，但是峰高和峰面积有所下降。因此柱温最终确定为50℃。

这样的分离条件下，样品的色谱分离时间是45min，丙烯酰胺的保留时间是36.8 min。

3.4样品的处理

3.4.1提取剂的选择

图3　不同柱温所得丙烯酰胺标准品色谱图Fig.3The standard color spectrum of Acrylamide under different column temperature

实验中分别对甲醇，水，甲醇水溶液进行比较，以找到合适的提取溶剂。由于样品中的淀粉溶胀的作用，需要水的量比较多，而在纯化前提取液需要浓缩，尤其是当样品中丙烯酰胺的浓度比较的情况下更需要浓缩。由于水在温和的条件下进行浓缩比较困难，乙酸乙酯曾用来萃取水相中的丙烯酰胺，然后将乙酸乙酯用旋转蒸发蒸干，但是回收率很低。甲醇虽然比较容易浓缩，但是甲醇的结果也不理想。将甲醇与水的比例从50%变化到90%（体积比），结果表明75%的甲醇水溶液合适，既能在氮气流于45℃的条件下蒸发，回收率又比较高。因此，将75%（体积比）的甲醇水溶液用作提取剂。

3.4.2蛋白质的沉淀剂

Carrez试剂用来沉淀提取液中的蛋白质。Carrez试剂的作用在色谱图上比较溶液观察到。无论丙烯酰胺的提取与蛋白质的沉淀是一步完成，还是先提取丙烯酰胺然后再沉淀蛋白，都能从色谱图上看出Carrez试剂纯化的效果。在提取丙烯酰胺的同时沉淀蛋白质，能简化样品处理程序缩短分析时间。

3.4.3SPE纯化

在SPE纯化步骤，对Accu BondⅡODS-C18柱（6 mL，500 mg）和Oasis HLB柱（6 mL，200 mg）进行了比较。它们的纯化效果相近，但是Oasis HLB柱的回收率较高，见图4。

图4　面包中丙烯酰胺的色谱图Fig.4Chromatogram of acrylamide in bread

提取液经过纯化之后的色谱图较干净，在丙烯酰胺出峰的时间没有干扰峰出现。

3.5方法评价

3.5.1标准溶液的精密度

定量分析是在50 μg/L～300 μg/L的线性范围内依据丙烯酰胺的浓度与峰面积之间的关系进行的。保留时间的精密度是通过日内和日间精密度实验进行的：150 μg/L的标准溶液连续6 d，每天进行3次，每次重复6次实验。相关数据总结在表1中。在整个线性范围内相关性很好。保留时间的日内和日间精密度都在1%以下。

表1　分析丙烯酰胺标准品的方法评价Table 1Evaluation methods for analysis of acrylamide standard

3.5.2样品的精密度

应用此方法分析面包中的丙烯酰胺，并对方法进行评价。表2中总结了日间、日内精密度结果，RSD值在3.6%～8.5%范围内变化。

表2　分析面包中丙烯酰胺的日间和日内精密度Table 2Analysis of acrylamide in bread during the day and within day precision

3.5.3灵敏度

以3倍信噪比计算，本方法的灵敏度为30 μg/kg，达到LC-MS/MS法灵敏度（20 μg/kg～50 μg/kg）。

3.5.4回收率

为了验证方法的准确性，在空白基质中添加不同水平（50 μg/kg～300 μg/kg）的丙烯酰胺标准品。平均回收率在92%～105%之间变化，见表3。

表3　空白基质中添加丙烯酰胺标准品计算回收率Table 3The blank matrix added standard acrylamide and recovery calculation

3.6面包中丙烯酰胺的含量

对市售的面包中丙烯酰胺含量进行分析检测，见表4。

表4　市售面包中丙烯酰胺含量分析（n=3）Table 4The analysis of acrylamide content in bread for sale

由表4可知，所得结果与文献报道的面包中的丙烯酰胺含量相近。这些结果表明此方法能够检测面包中的丙烯酰胺含量。

4结论与展望

对液相色谱分析食品中丙烯酰胺的方法进行了改进，能够应用于淀粉基质食品中。本方法相对于串联质谱的检测方法在仪器费用上能节省很多，能够被多数实验室广泛接受。样品处理简单快速，应用75%甲醇水溶液作为提取剂，浓缩，经SPE纯化，应用紫外检测器检测。与常用的反相色谱柱不同，丙烯酰胺以阳离子的形式在HC-75H+色谱柱上能较好的保留，因而能与共溶出物很好地分离。本方法可为一种低成本的分析淀粉基质食品中丙烯酰胺含量在100 μg/kg～500 μg/kg范围内的可选方法提供参考。

［1］SNFA.Swedish National Food Administration.Acrylamide is formed during the preparation of food and occurs in many foodstuffs.Press release from Livsmedelsverket，Swedish National Food Administration.April 24，2002

［2］WHO.FAO/WHO Consultation on the Health Implications of AcrylamideinFood［R］.SummaryReportofameetingheldinGeneva，2002

［3］简黎黎，刘洁，袁媛，等.HPLC-MS/MS法定量测定方便面中的丙烯酰胺［J］.食品工业科技，2009，30（12）：391-394

［4］张前龙，曹云.食品中丙烯酰胺分析方法研究进展［J］.上海预防医学，2010，22（2）：100-105

Study on Improvement of Methods for Analysis of Acrylamide in Bread

FU Miao-miao
（Henan Industrial and Traele Vocationd College，Zhengzhou 450012，Henan，China）

After the high temperature baking，bread will cause harm to human health because of acrylamide. Aiming at the improvement of the methods for analysis of acrylamide in bread were studied，to establish a set of simple and practical test methods of acrylamide，hope to provide the basis for the study on inhibition of acrylamide in food，thus to improve the safety of baking food，reduce health risks to consumers，positive significance.

bread；acrylamide；analysis method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.025

2014-09-02

付苗苗（1981—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：粮油加工与食品品质。