赵国群，王维

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）

比色法快速测定γ-氨基丁酸含量

赵国群，王维

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）

当有乙醛酸、琥珀酸存在时，γ-氨基丁酸（GABA）与溴甲酚绿发生专一的、特殊的显色反应。基于这一显色反应，建立了一种新的快速测定GABA含量的比色法。显色剂中溴甲酚绿、琥珀酸和乙醛酸溶液的适宜浓度分别为0.5、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL。测定GABA含量的适宜条件为：4 mL样品溶液，加入2 mL显色剂，混合摇匀，在25℃下水浴5 min，于617 nm测定吸光值。其它氨基酸如谷氨酸对GABA测定有一定的影响。

γ-氨基丁酸；比色法；溴甲酚绿

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）是一种非蛋白质的天然氨基酸，广泛存在于植物、动物和微生物中，大多由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧产生的［1］。GABA具有降血压、改善肝功能、调节激素分泌、改善睡眠、增强记忆力、抗衰老、防治肥胖等重要生理作用，被广泛应用于食品、医药等领域［2-3］。GABA的生产方法有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法［4］。

目前GABA的检测方法有很多，主要有液相色谱法［5-6］、氨基酸分析仪法［7］、毛细管电泳法［8］、纸上电泳法［9］、酶联荧光法［10］、放射性免疫法［11］等，但以上方法大多前处理过程复杂、费时长、检测成本高，不宜用于大批量样品的定量分析。陈恩成等基于Berthelot显色反应，研究出了使用紫外-可见分光光度计快速测定GABA的比色法［12］，但这种方法对操作过程要求高，使用非环境友好型试剂苯酚和次氯酸钠等，且检测时间仍较长。

黄丽华等［13］在筛选高产GABA的酵母菌株时，使用了一种含有溴甲酚绿的筛选培养基。这种培养基对GABA具有显色专一性，从而可快速地初筛出GABA高产菌株。本文在此基础上，研究建立了一种简单、快速测定GABA的分光光度比色法。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

GABA：美国Sigma公司；溴甲酚绿：天津市百世化工有限公司；琥珀酸：天津市博迪化工有限公司；50%乙醛酸：上海源叶生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

SP-752型紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；数显恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1筛选培养基

YEPD培养基+0.01%溴甲酚绿+0.2%乙醛酸+ 0.2%琥珀酸［13］。

1.2.2显色剂的配制

分别用去离子水配制0.5 mg/mL溴甲酚绿、4.0 mg/mL琥珀酸和6.0mg/mL乙醛酸溶液，将以上3种溶液按照1∶1∶1的比例混合均匀，即制成显色剂。

1.2.3GABA比色法检测的可行性研究

用去离子水分别配制浓度为10 mg/mL的柠檬酸、草酸、乳酸、盐酸、硫酸、磷酸和GABA溶液20 mL。然后，依次将上述酸溶液滴加在筛选培养基上，观察其显色情况。分别用去离子水配制浓度1.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL和9.0 mg/mL GABA溶液，取4.0 mL加入比色管中，然后加入2.0 mL显色剂，混匀，静置，观察其色泽变化。

1.2.4检测波长的选择

吸取6.0mg/mLGABA标准溶液4.0mL，加入2.0mL显色剂，混合均匀，静置5 min后，在紫外-可见分光光度计上对该溶液进行波长扫描。

1.2.5显色条件的影响

1.2.5.1反应温度的影响

吸取6.0mg/mLGABA标准溶液4.0mL，加入2.0mL显色剂，混合均匀。分别在15、20、25、30、35、40、45、50℃下水浴5 min，于617 nm测定吸光值。

1.2.5.2溴甲酚绿浓度的影响

分别配制0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL和0.9 mg/mL溴甲酚绿溶液，并与4.0 mg/mL琥珀酸和6.0 mg/mL乙醛酸，按照1∶1∶1配成显色剂。吸取6.0 mg/mLGABA标准溶液4.0 mL，加入2.0 mL上述显色剂，混合均匀，室温（约25℃）下静置5 min，于617 nm测定吸光值。

1.2.5.3琥珀酸、乙醛酸浓度的影响

分别配制1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL和8.0 mg/mL琥珀酸/乙醛酸溶液，并与0.5 mg/mL溴甲酚绿和6.0 mg/mL乙醛酸/4.0 mg/mL琥珀酸溶液，按照1∶1∶1配成显色剂。其它操作同1.2.5.2。

1.2.6显色稳定性实验

吸取6.0 mg/mLGABA标准溶液4.0 mL，与2.0 mL显色剂混合。然后，在25℃下水浴，于617nm每隔5分钟测定一次吸光值，共12次。

1.2.7标准曲线的建立

分别准确吸取1.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL和9.0 mg/mL GABA标准溶液4.0 mL，加入2.0 mL显色剂，混合摇匀，在25℃下水浴5 min，于617 nm测定吸光值。

1.2.8其他氨基酸对GABA测定的影响

分别配制甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸和组氨酸4.0 mg/mL标准溶液，各取2.0 mL分别与2.0mL4.0mg/mL的GABA标准溶液混合，再加入2.0mL显色剂，混合摇匀，25℃水浴5 min，于617 nm测定吸光值。同时测定2.0 mg/mLGABA标准溶液的吸光值。

1.2.9精密度实验

精确吸取4.0 mg/mLGABA标准溶液，按照1.2.7方法进行同样操作，测定吸光值。

1.2.10回收率实验

分别精确吸取5.0 mL 2.0 mg/mL和6.0 mg/mL的GABA标准溶液，分别加入5.0 mL 4.0 mg/mL的GABA标准溶液，混合均匀，按1.2.7方法进行测定，分别重复试验3次。

2结果与讨论

2.1GABA比色法检测的可行性

溴甲酚绿是一种常用的酸碱指示剂，pH=3.8时呈黄色，pH=5.4时呈蓝绿色，其颜色变化能灵敏的指示溶液中酸度的变化［14］。黄丽华等［13］在筛选高产GABA酵母菌株时，发现当溴甲酚绿与乙醛酸、琥珀酸共存时，对GABA具有显色专一性。为了验证其显色专一性，试验了6种常见酸，结果见图1。

图1　GABA与其它酸在筛选培养基上的显色Fig.1The chromogenic results of GABA and other acids in the screening cultural medium

从图1中可以清楚地看出，柠檬酸、草酸、乳酸、盐酸、硫酸、磷酸溶液在筛选培养基上均不显色，只有GABA显示出黄绿色。当将GABA溶液与溴甲酚绿溶液混合时，反应液呈深蓝色（结果未显示）。这个结果表明，当有乙醛酸、琥珀酸存在时，常见的有机酸和无机酸不再使得溴甲酚绿变色；而溴甲酚绿却可与GABA发生专一的、特殊的显色反应，但其反应机理和成色物质的结构尚不清楚，可能是形成了复合物。讨论，是否可利用这种专一的显色反应来检测GABA呢？不同浓度GABA的显色效果见2。

图2　不同浓度GABA的显色效果Fig.2The chromogenic result of GABA in different concentrations

随着GABA浓度的增加，GABA溶液的色泽由浅黄转变为黄绿、绿色，而且绿色越来越深。因此，初步判断采用比色法定量检测GABA是可行的。

2.2检测波长的选择

将GABA与显色剂混合显色后，在紫外-可见分光光度计上，对GABA显色液于500 nm～700 nm范围内进行波长扫描，扫描结果见图3。

图3　GABA显色液的扫描曲线Fig.3Scanning curve of GABA chromogenic solution

由图3可以看出，显色液在617 nm处有最大吸收峰，因此，选择617 nm作为检测波长。

2.3显色条件对显色反应的影响

2.3.1反应温度的影响

温度对显色反应的影响见图4。

图4　温度对显色反应的影响Fig.4Effect of temperature on the chromogenic reaction

从图4可以看出，当温度在15℃～25℃时，反应温度对显色反应后溶液的吸光度几乎没有影响。当反应温度超过25℃时，随着温度的升高，显色液吸光度逐渐减小。因此，适宜的反应温度为25℃。

2.3.2溴甲酚绿浓度的影响

溴甲酚绿浓度的影响见图5。

图5　溴甲酚绿浓度对显色反应的影响Fig.5Effect of bromcresol green's concentration on the chromogenic reaction

如图5所示，随着显示剂中溴甲酚绿浓度的升高，反应液的吸光值几乎呈线性增加。从1.2.3实验可知，乙醛酸和琥珀酸的存在才使得溴甲酚绿可与GABA发生专一的显色反应，那么，乙醛酸、琥珀酸应与溴甲酚绿存在一定比例关系。如果溴甲酚绿的浓度过高，会造成显色剂中只有部分溴甲酚绿与GABA发生专一的显色反应，从而影响测定的准确性。因此，显色剂中溴甲酚绿浓度的选择不能仅以吸光度的高低作为评价指标。

2.3.3琥珀酸、乙醛酸浓度的影响

分别调整显色剂中琥珀酸、乙醛酸的浓度，然后与6.0 mg/mL GABA标准溶液混合显色，实验结果见图6。

图6　琥珀酸、乙醛酸浓度对显色反应的影响Fig.6Effect of glyoxylic acid’s and succinic acid’s concentrations on the chromogenic reaction

从图6可以发现，随着显色剂中琥珀酸、乙醛酸浓度的增加，显色反应后溶液的吸光度均逐渐减小。在同样GABA浓度下，较高的乙醛酸浓度会使得反应液色泽变浅，吸光值变小。在GABA与溴甲酚绿的特殊显色反应中，琥珀酸、乙醛酸、溴甲酚绿和GABA会存在一定的比例关系。降低显示剂中琥珀酸、乙醛酸的浓度可提高反应液的吸光度，但二者浓度过低时，会影响GABA与溴甲酚绿的特殊显色反应，从而影响测定结果的准确性。故此，显色剂中琥珀酸、乙醛酸浓度的选择也不能仅以吸光度作为评价指标。

以GABA标准曲线的R2及吸光度作为评价指标，通过多次试验，最终确定溴甲酚绿、琥珀酸、乙醛酸溶液的最佳浓度分别为0.5、4.0、6.0 mg/mL。

2.4显色稳定性

显色稳定性是比色法检测的一个重要的参数。GABA溶液与显色剂混合后，在25℃下水浴1 h，每隔5分钟测定一次吸光度，并计算标准偏差、相对标准偏差，实验结果见表1。

表1　GABA反应液1h显色稳定性（n=12）Table 1The colour stability of GABA reaction solution in 1 h（n=12）

在1 h放置时间内，反应液吸光度的变化很小，其相对标准偏差仅为0.21%，这说明显色非常稳定。

2.5标准曲线的建立

按照实验设计，准确配制不同浓度GABA标准溶液，按照上述方法测定其617 nm处的吸光值。以GABA浓度为横坐标（C），吸光值为纵坐标（A）进行做图，GABA的标准曲线见图7。

图7　GABA标准曲线Fig.7Standard curve of GABA

经过数据分析，GABA标准曲线的回归方程为A= 0.126 8C－0.026 7，相关系数R2=0.995 8。待测液中GABA浓度在0～9.00 mg/mL的范围内与吸光度的相关性较好。基于Berthelot显色反应，陈恩成等［12］、孙波等［15］研究了快速测定糙米、酶转化反应液中GABA含量的比色法，其GABA标准曲线的R2达到了0.999，GABA检测范围为0～1.00 mg/mL，即Berthelot比色法的检测准确度优于本法，其检测下限也远低于本法。但是，本法操作更简便，检测速度也更快，非环境友好型试剂的使用更少。目前微生物发酵法生产GABA主要是利用乳酸菌来实现的，其GABA产量一般较高。缪存影等［16］从酸菜中分离筛选出了高产GABA乳酸菌，其发酵液中GABA含量可达13.4 mg/mL。张术聪等［17］以L-谷氨酸为底物，利用植物乳杆菌全细胞进行转化，转化液中GABA浓度达到140 mg/mL。因此，本法非常适合应用于GABA的工业发酵及GABA的发酵工艺研究等科研工作，可很简便地来分析和监测发酵液中的GABA含量。

2.6其他氨基酸对GABA测定的影响

选取甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸和组氨酸作为代表，研究了6种氨基酸对GABA测定的影响，实验结果见图8。

图8　其他氨基酸对GABA测定的影响Fig.8Effect of other amino acids on determination of GABA

从图8中可以发现，其他氨基酸对GABA含量的测定有一定的影响。以2 mg/mLGABA吸光度作为对照，甘氨酸、赖氨酸、色氨酸、丙氨酸和组氨酸的存在会使得GABA测定值偏高，而谷氨酸的存在会使得GABA测定值偏低。在本实验条件下，色氨酸使得GABA吸光值增高3.2%；甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸和组氨酸使得GABA吸光值增高在10%～15.2%；谷氨酸使得GABA吸光值降低13.5%。当然，在实际的测定中，其他共存氨基酸的影响大小还取决于具体的测定环境。尽管其他氨基酸对GABA测定有一定的干扰，但本法仍不失为一种非常简便的测定方法，尤其是对于GABA工业发酵以及在实验室进行的GABA发酵工艺研究，GABA测定的精确度要求不高或可以降低测定精确度要求，很适合采用本法测定GABA的含量。

2.7精密度实验

精确吸取4.0 mg/mLGABA标准溶液，重复测定6次，在617 nm处的吸光值分别为0.322、0.326、0.321、0.319、0.322、0.318，相对标准偏差（RSD）为0.88%，RSD远远低于5%，表明本方法具有良好的重现性。

2.8回收率实验

按照1.2.10的实验方法进行加样回收率实验，结果见表2。

表2　加样回收率实验结果Table 2Results of recovery test

如表2所示，加样平均回收率为95.33%，平均RSD为1.26%，说明本方法准确性较好。

3结论

当有乙醛酸、琥珀酸存在时，GABA与溴甲酚绿发生专一的、特殊的显色反应。反应液在617 nm处有最大吸收峰。随着GABA浓度的增加，反应液的绿色越来越深。基于上述显色反应，建立了一种可简便、快速测定GABA含量的新比色法。组成显色剂的溴甲酚绿、琥珀酸和乙醛酸溶液的适宜浓度分别为0.5、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL。将以上3种溶液按照1∶1∶1的比例混合均匀，即制成显色剂。适宜的显色条件为：4 mL样品溶液，加入2 mL显色剂，混合摇匀，在25℃下水浴5min。GABA标准曲线的回归方程为A=0.126 8C－0.026 7，相关系数R2=0.995 8。本检测方法的精密度（重复测定样品的RSD）为0.88%，平均回收率为95.33%，说明本方法重现性和准确性较好。其它氨基酸如谷氨酸对GABA的测定结果有一定的影响。本方法的精确度略低于Berthelot比色法，检测下限也远高于Berthelot比色法。但是，本方法操作更简单、检测时间更短、检测成本更低，非常适合大批量样品如GABA发酵液的快速检测。

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A Rapid Colorimetric Method for Determination of γ-Aminobutyric Acid

ZHAO Guo-qun，WANG Wei
（College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

γ-aminobutyric acid（GABA）had a unique reaction with bromcresol green when glyoxylic acid and succinic acid were present with them.A new colorimetric method for rapid determination of GABA was developed based on the reaction above.The optimal concentrations of bromcresol green，glyoxylic acid and succinic acid in the chromogenic agent were 0.5，4.0 mg/mL and 6.0 mg/mL respectively.The optimal condition for determination of GABA was that 4 mL sample was mixed with 2 mL chromogenic agent，and the absorbance of the mixed solution was determined in a spectrophotometer at 617 nm after it was kept in a water bath at 25℃for 5 min.It was found that other amino acids such as glutamate acid had some disturbance.

γ-Aminobutyric acid；colorimetric method；bromcresol green

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.024

2014-04-12

赵国群（1963—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品生物技术。