杨莉等

摘要：以阿勒泰羊为研究对象，对脂肪酸合成酶（FAS）基因、脂蛋白酯酶（LPL）部分编码区的cDNA进行克隆、测序，与GenBank中已收录的其他11种动物的FAS、LPL基因序列进行同源性分析，并构建分子进化树。结果显示，所克隆的FAS、LPL基因与绵羊的基因序列同源性最高，分别为99.61%、100.00%；FAS基因与虎鲸同源性最低，为46.24%；LPL基因与罗非鱼的序列同源性最低，为56.28%。结果均正确地反映了物种间的进化关系，序列分析结果为人们进一步对阿勒泰羊脂肪的相关研究、肉质性状的研究及育种提供了理论基础，同时也为阿勒泰羊FAS、LPL基因的生物学功能、遗传进化研究提供了分子依据。

关键词：硬脂酰辅酶A去饱和酶；脂肪酸合成酶；脂蛋白酯酶；序列分析；阿勒泰羊

中图分类号： S811.3；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0043-03

新疆阿勒泰地区位于中国西北边陲，冬季长达半年，许多优良绵羊品种无法适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，而阿勒泰羊以其全身肌肉丰满、体型肥硕、尾根附近沉积大量脂肪、耐粗饲、抗寒性强等特点，能够适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，成为当地的优良类群[1]。脂肪酸的合成是由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成甘油三脂（TAG）[2]，FAS表达水平的高低能够直接影响甘油三脂在体内的沉积[3]，因此FAS是脂肪酸合成代谢的关键酶。Hsu等分离得到人脂肪酸合成酶代谢调控基因，发现人的脂肪酸合成酶基因位于17q25[4]。Kameda等对鹅脂肪酸合成酶代谢调控基因作了研究，发现脂肪酸合成酶代谢调控基因全序列长度大约有 50 kb，同时现已知牛的基因位于19q22、鸡的基因位于18号染色体上[5]。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是机体脂质和脂蛋白代谢的关键酶，是分解循环脂蛋白中乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯，释放出脂肪酸和甘油的限速酶[6]，作为影响脂肪沉积的一个重要遗传标记，研究LPL表达水平对加快肉品质改进速度具有重要的意义。本研究对阿勒泰羊的FAS、LPL基因部分片段进行了克隆、测序，并与已报道的其他物种的相应基因进行序列分析，以期在分子水平的基础上为家畜的改良育种提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

选择新疆福海县5只健康成年的阿勒泰羊，采集阿勒泰羊颈部肌间脂肪、胸部肌间脂肪、腹部肌间脂肪、腿部肌间脂肪、尾部脂肪、肝脏等6个部位的组织，立即放入液氮罐速冻，转入-80 ℃冰箱中保存。

TRIzol、DEPC、DNA marker、Taq PCR Master Mix，购自天根生物科技服务有限公司；PrimeScript@RT reagent kit反转录试剂盒（批号：RR047A），购自TaKaRa公司（批号：DRR420A）；DNA凝胶回收试剂盒（批号：DP209-02）、胰蛋白胨、琼脂粉、琼脂糖、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇，购自北京华美生物工程公司；感受态细胞E.coli DH5α由石河子大学动物科技学院传染病实验室保存。

1.2试验方法

1.2.1目的基因引物设计以GenBank中已发布的绵羊FAS基因（登录号：NM_001009254.1）、LPL基因（登录号：NM_001009394.1 ）为模版，用Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京六合华大基因有限公司合成。FAS基因上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′；目的片段长度为256 bp。LPL基因上游引物：5′-GATTAGCGATTCCTACTTCAGC-3′；下游引物：5′-AGACTTGTCATGGCATTTCAC-3′；目的片段长度为181 bp。

1.2.2RNA的提取利用TRIzol一步法提取试验样品的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，于-70 ℃保存备用。然后依次加入以下试剂：1 μg RNA、10× Reaction buffer、1 μL MgCl2、1 μL DNase Ⅰ（RNase-free），用DEPC处理水补足至10 μL，除去存在的少量基因组 DNA。于37 ℃反应 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃孵化10 min，即可用此RNA作为反转录模板。以RNase-free水为对照，用紫外分光光度计测定D260 nm/D280 nm值、总RNA浓度。

1.2.3反转录向提取纯化好的各组织的总RNA中加入以下试剂：2 μL 5×gDNA Eraser bufferⅠ、1 μL 5 xgDNA EraserⅠ、1 μL总RNA，用无核酸酶水补足至10 μL。然后于42 ℃孵育混合物3 min，冷却后向下旋转混匀，将管子放回冰上。再向以上反应液中按指定顺序加入如下试剂：4 μL无核酸酶水Ⅰ、4 μL 5×PrimeScript buffer 2、1 μL RT Prime MixⅠ、1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ，终体积为20 μL。加完样后轻柔混合，短暂离心，然后于37 ℃孵育混合物30 min，最后于85 ℃加热5 s终止反应。反转录产物可直接用于PCR扩增，或于-20 ℃保存（3个月以内），长期保存建议放于-70 ℃。

1.2.4目的基因PCR反应及克隆测序利用常规PCR反应对组织样品中FAS、LPL基因进行扩增，将目标片段分别从琼脂糖凝胶中切下，按照DNA回收试剂盒说明回收目的片段，在T4-DNA连接酶作用下，经16 ℃过夜连接PGEM-T Easy载体，用CaCl2法将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性菌落后，挑取单菌落进行培养，然后从菌液中提取质粒，菌液送往上海华大基因科技有限公司测序。

1.2.5基因序列分析采用DNAMAN软件对GenBank中绵羊、山羊、牛、猪、斑马鱼、褐家鼠、马等11个物种和测序后的阿勒泰羊FAS、LPL基因的编码区核苷酸序列进行同源比对分析。用MEGA5.1软件构建进化树，进行遗传进化分析。

2结果与分析

2.1提取总RNA

提取的总RNA经紫外分光光度计测定，D260 nm/D280 nm在1.8～2.0间，表明提取的总RNA无蛋白质和苯酚污染，纯度较高，可用于后续试验。

2.2FAS基因的RT-RCR扩增

以RNA反转录的cDNA为模板，以FAS、LPL的上、下游引物扩增，分别得到256、181 bp的条带（图1、图2）。

2.3FAS、LPL基因测序结果与序列分析

将阿勒泰羊的FAS基因核苷酸序列与已公布的绵羊的相应序列进行分析比对，结果显示序列同源性为99.61%；通过与GenBank数据库中绵羊、牛、小鼠等11个物种进行核苷酸序列比对发现，阿勒泰羊FAS基因与绵羊的序列同源性最高，与西农萨能奶山羊的序列同源性最低；与牛、马、人、猪、褐家鼠的序列同源性均在80%～95%之间；与鸽、鸡的序列同源性分别为72.66%、71.88%；与虎鲸的序列同源性最低，为46.24%（表1）。结果与传统分类相一致。

2.4系统发育树分析

采用MEGA 5.0软件构建了FAS基因系统发育树。从图3可以看出，大分支分为2类，虎鲸为1个分支；其余10个物种聚为一大类，首先禽类的鸽子和鸡成为一类，后与马、褐家鼠以及人、猪聚成的小类合成一类，最后与平行的哺乳纲偶蹄目的绵羊、阿勒泰羊、山羊以及西农萨能奶山羊以及牛聚为一大类。

从LPL的基因系统发育树中可以看出，主支分为2支，第1主支以阿勒泰羊、牛、马、人、鸡等11个物种组成，另1支为罗非鱼。其中第1主支又分为5个分支，第1分支为阿勒泰羊与绵羊；第2分支主要为山羊、牛、猫、马；第3分支为东非狒狒、人；第4分支为小家鼠、豚鼠；第5分支为鸡（图4）。

3讨论

脂肪的合成代谢与分解代谢始终处于一个平衡状态，主要是由甘油三酯的酯化、分解这2个过程主导，其相对速度决定了脂肪的分解或储存。FAS是脂肪合成的关键酶，LPL可以催化乳糜微粒、极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，因此对FAS、LPL基因的研究有助于深入了解脂肪代谢的分子机制。

有关人、鼠、猪、牛等哺乳动物 FAS 基因的结构、定位、表达研究已有报道[7-9]，从序列分析可以看出，阿勒泰羊FAS基因与羊亚科的西农萨能奶山羊的序列同源性较低，这可能与地理环境的差异有关。Krichgessner等从绵羊脂肪组织中克隆测序得到1 656 bp的部分LPL基因序列[10-11]；为获得绵羊全长LPL基因，Bonnet等通过3′-RACE方法获得了1 917 bp的绵羊LPL基因序列[12]，并与Edwards等获得的 LPL基因序列拼接后得到共3 529 bp的绵羊LPL全长cDNA序列，通过Southern Blotting方法定位在绵羊第2号染色体上。本试验克隆测序阿勒泰羊LPL基因的cDNA发现，与GenBank中收录的9种哺乳动物中LPL基因cDNA序列表现了较高的同源性及进化上的保守性。

采用MEGA5.0 软件构建了FAS与LPL基因的系统进化树，进化树上分支节点越近，说明基因序列间遗传距离也相对较近；11个物种构建的系统进化树表明FAS基因中阿勒泰羊和绵羊具有最近的遗传关系，而与虎鲸的亲缘关系最远，LPL基因与罗非鱼的亲缘关系较远，其结果均正确地反映了物种间的进化关系。

随着分子生物学技术的出现和不断成熟，人们从分子生物学水平对脂肪代谢的调控进行了一些探索性的研究，而本研究获得了阿勒泰羊FAS、LPL基因的部分序列，为人们进一步对阿勒泰羊脂肪相关的研究和肉质性状的研究以及育种提供了理论基础，同时也为今后研究阿勒泰羊与牛亚科等近缘物种间分子进化和遗传分化奠定了一定的理论基础。

参考文献：

[1]李金保，别克·木哈买提，库拉西，等. 地方良种阿勒泰羊[J]. 新疆畜牧业，2008（1）：31-33.

[2]Clarke S D. Regulation of fatty acid synthase gene expression：an approach for reducing fat accumulation[J]. Journal of Animal Science，1993，71（7）：1957-1965.

[3]Jayakumar A，Tai M H，Huang W Y，et al. Human fatty acid synthase：properties and molecular cloning[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1995，92（19）：8695-8699.

[4]Hsu M H，Chirala S S，Wakil S J. Human fatty-acid synthase gene[J]. The Journal of Biological Chemistry，1996，271：13584-13592.

[5]Kameda K，Goodridge A G. Isolation and partial characterization of the gene for goose fatty acid synthase[J]. The Journal of Biological Chemistry，1991，266（1）：419-426.

[6]Goldberg I J. Lipoprotein lipase and lipolysis：central roles in lipoprotein metabolism and atherogenesis[J]. Journal of Lipid Research，1996，37（4）：693-707.

[7]Morris C A，Cullen N G，Glass B C，et al. Fatty acid synthase effects on bovine adipose fat and milk fat[J]. Mammalian Genome，2007，18（1）：64-74.

[8]Muoz G，Ovilo C，Noguera J L，et al. Assignment of the fatty acid synthase （FASN） gene to pig chromosome 12 by physical and linkage mapping[J]. Animal Genetics，2003，34（3）：234-235.

[9]Roy R，Gautier M，Hayes H，et al. Assignment of the fatty acid synthase （FASN） gene to bovine chromosome 19 （19q22） by in situ hybridization and confirmation by somatic cell hybrid mapping[J]. Cytogenetics and Cell Genetics，2001，93（1/2）：141-142.

[10]Kirchgessner T G，Chuat J C，Heinzmann C，et al. Organization of the human lipoprotein lipase gene and evolution of the lipase gene family[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1989，86（24）：9647-9651.

[11]Edwards W D，Daniels S E，Page R A，et al. Cloning and sequencing of a full length cDNA encoding ovine lipoprotein lipase[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1993，1172（1/2）：167-170.

[12]Bonnet M，Leroux C，Chilliard Y，et al. Rapid communication：nucleotide sequence of the ovine lipoprotein lipase cDNA[J]. Journal of Animal Science，2000，78（11）：2994-2995.