玉叶金花苷酸甲酯抗炎、镇痛、抑菌作用研究

2015-10-18潘利明

中成药 2015年3期

关键词：玉叶扭体热板

潘利明，林励

（1.广东药学院中药学院，广东　广州　510006；2.广州中医药大学中药学院，广东　广州　510006）

玉叶金花苷酸甲酯抗炎、镇痛、抑菌作用研究

潘利明1，林励2*

（1.广东药学院中药学院，广东广州510006；2.广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

目的研究玉叶金花苷酸甲酯的抗炎、镇痛、抑菌作用。方法以二甲苯致小鼠耳肿胀模型观察其抗炎作用；通过醋酸致小鼠扭体实验及热板法实验观察其镇痛作用；研究玉叶金花苷酸甲酯对7种常见细菌的抑制效果，采用纸片扩散法观察抑菌圈直径，采用连续稀释法测定最低抑菌质量浓度（MIC）。结果玉叶金花苷酸甲酯的中、高剂量（0.10、0.15 g/kg）能显著减轻二甲苯致炎小鼠的耳肿胀度（P＜0.05）；对于由醋酸引起的小鼠扭体反应，玉叶金花苷酸甲酯各剂量组与空白组比较，有显著性差异；在小鼠热板实验中，与空白对照组相比，玉叶金花苷酸甲酯中、高剂量（0.10、0.15 g/kg）对热刺激引发的小鼠痛反应时间有明显的延长作用；玉叶金花苷酸甲酯对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌均有抑制作用，其MIC分别为2.5、10、0.312 5、1.25、1.25、10、0.625 mg/mL。结论玉叶金花苷酸甲酯具有明显的抗炎、镇痛及抗菌作用。

玉叶金花苷酸甲酯；玉叶金花；抗炎作用；镇痛作用；抑菌作用

玉叶金花苷酸甲酯（mussaenoside）是一种环烯醚萜苷成分，本课题组在前期工作中从茜草科植物玉叶金花Mussaenda Pubescens Ait.f.中分离得到。玉叶金花具有清热解暑、凉血解毒等功效，用于感冒、中暑、发热、咳嗽、肠炎、肾炎水肿、咽喉肿痛、跌打、蛇伤，以及断肠草、木薯、野菌中毒等症［1-3］。本课题组已证实玉叶金花水提物具有明显的抗炎及抗菌作用［4］，为了证实玉叶金花苷酸甲酯是否为玉叶金花药材抗炎、镇痛及抗菌作用的药效物质基础，开展了本研究。

1　动物、仪器与材料

1.1动物昆明种小鼠，18～22 g，雌雄兼用，由广东药学院实验动物中心提供，符合SPF级标准，许可证号Y2012-0125。

1.2药品与试剂玉叶金花苷酸甲酯由本研究室分离纯化并鉴定结构，采用HPLC归一法测定其纯度大于98%；阿斯匹林，山东新华制药有限公司，批号20110409；化学致痛剂使用0.7%醋酸溶液；牛肉膏（中国进出口检验技术研究所）；蛋白胨（广东环凯生物科技有限公司）；琼脂（广东省汕头市水产品综合加工厂）；酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

1.3仪器 YPB1003型电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）；PV-200型足肿容积测量仪（成都泰盟科技有限公司）；ZXC-3R型恒温自控热板仪（石家庄市永丰电子通讯设备厂；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SW-CJ-1F型洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；303-4A型电热恒温培养箱（上海迅能电热设备有限公司）；RE3000C型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.4供试菌株大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 8739）、伤寒杆菌（Salmonella enteric，ATCC 14028）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，ATCC 700603）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae，CMCC 43501）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（Peudomonas aeruginosa，ATCC 9027）、痢疾杆菌（Shigella，CMCC 51252）均由广东药学院微生物学与免疫学教研室提供。

2　方法

2.1玉叶金花苷酸甲酯溶液的配制精密称取玉叶金花苷酸甲酯0.75 g，至50 mL量瓶中，加适量生理盐水溶解，定容至刻度，摇匀，得15 mg/m L的玉叶金花苷酸甲酯溶液，冷藏备用。

2.2抗炎试验［5-6］对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响取小鼠60只，雌雄各半，随机均分5组，即空白对照组，阳性对照组，玉叶金花苷酸甲酯高、中、低剂量组。阳性对照组按0.2 g/kg给予阿司匹林混悬液，空白对照组给予等量生理盐水，玉叶金花苷酸甲酯给药组分别按0.15、0.10、0.05 g/kg灌胃给药，每日1次，连续4 d。于末次给药1 h后，各组小鼠均右耳廓正反面均匀涂布二甲苯每只0.05 mL，左耳不涂为正常耳。致炎肿胀后1 h，脱颈椎处死小鼠，每鼠剪下左、右两耳片，用6 mm直径打孔器分别在同一部位打下两耳片，电子天平称定质量，以左、右耳片质量之差作为肿胀度，比较各组间差异，计算肿胀度（mg）及肿胀抑制率，肿胀抑制率=［（空白对照组肿胀度-给药组肿胀度）/空白对照组肿胀度］×100%。

2.3镇痛试验

2.3.1醋酸所致小鼠扭体试验［7-8］动物分组、给药剂量及给药方式同“2.2”项，连续6 d。最后一次给药1 h后，腹腔注射0.7%冰醋酸（0.01 mL/g）。记录各组小鼠15 min内扭体（腹部收缩内凹、伸展后肢）的次数。以［（空白组扭体均数-受试组扭体均数）/空白组扭体均数］× l00%作为受试组抑制率。并比较各给药组与空白组15 min内的扭体次数是否存在统计学差异。

2.3.2热板试验［9-10］取18～22 g雌性昆明种小鼠，实验前禁食12 h，饮水不限，将热板测痛仪预热至（55± 0.5）℃，测定小鼠的痛阈值。痛反应在5～30 s内为合格鼠，取2次正常痛阈平均值，作为该鼠给药前痛阈值。将合格小鼠随机分为5组，每组10只，给药剂量同“2.1.2”项下，连续灌胃6 d，于末次给药后30、60、90min分别测量小鼠痛阈值，以60 s为限，以免烫伤小鼠。以痛觉反应出现时间（潜伏期）长短为评价指标，痛阈提高的百分率=［（给药后的痛阈-基础痛阈）/基础痛阈］×100%。

2.4抑菌试验

2.4.1试剂的配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，氯化钠5.0 g，琼脂20 g，加热溶解于1 000 mL水中，调pH为7.4～7.6，分装，高压湿热灭菌（1.05 kg/cm2，121℃，20 min），备用。

肉汤培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化钠10.0 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中，调pH（7.0±0.1）分装，高压湿热灭菌（1.05 kg/cm2，121℃，20 min），备用。

菌悬液的制备：挑取活化好的菌落，用平板计数法计数，用无菌生理盐水调整菌液浓度约为1×106～1×107cfu/mL，备用。

玉叶金花苷酸甲酯溶液配制：精密称定玉叶金花苷酸甲酯适量，用无菌蒸馏水配制成0.2 g/mL溶液，置于4℃冰箱中冷藏备用。

2.4.2实验方法

2.4.2.1纸片扩散法测定抑菌效果［11-12］将灭菌后的培养基在超净工作台上冷却至50～60℃，每个培养皿加入约15 mL培养基。培养基凝固后，用无菌移液器加入0.1 mL的菌液，用涂布器将菌液涂匀。用无菌镊子将灭菌后直径6 mm的小圆滤纸片置入玉叶金花苷酸甲酯灭菌水溶液（低质量浓度为0.1 g/mL，高质量浓度为0.2 g/mL）中，浸泡2 h后取出，贴于平板上。每个纸片相隔一定间距，每种菌各设5个重复，然后以灭菌蒸馏水作为空白对照。将贴有滤纸片的培养皿放入培养箱中，细菌37℃下培养24 h。用游标卡尺测抑菌圈直径，取5次测量的平均值。

2.4.2.2最低抑菌质量浓度（MIC）的测定［13-15］采用2倍稀释法，将玉叶金花苷酸甲酯用灭菌蒸馏水稀释，分别和适量的营养肉汤相混合，得终质量浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1 mg/mL的不同溶液。将实验菌液（大肠杆菌、伤寒杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌）调整浓度为105～106cfu/mL，取0.1 mL分别接种各试管中，每个浓度设5个平行管，并分别设不含玉叶金花苷酸甲酯的对照管及不加菌液的对照管，置37℃培养箱培养24 h，观察有无细菌生长，肉汤清亮透明表示无细菌生长（-），肉汤浑浊表示有细菌生长（+），以能抑制细菌生长的提取物最高稀释度作为其最低抑菌质量浓度（MIC）。

3　统计学处理

数据均采用SPSS 19.0 for Windows统计分析软件分析处理，数据用±s表示，两组之间的比较用t检验。

4　结果

4.1抗炎试验致炎20 min后，各组小鼠右耳均可见高度红肿。数据结果见表1。

表1　玉叶金花苷酸甲酯对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响（±s，n=12）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别给药剂量/ g/kg耳肿胀度/ mg肿胀抑制率/ %空白对照组-6.24±2.75玉叶金花苷酸甲酯低剂量组0.05 5.55±2.30 11.05玉叶金花苷酸甲酯中剂量组0.10 3.89±1.17*37.66玉叶金花苷酸甲酯高剂量组0.15 2.17±1.14**65.22阿司匹林组0.20 3.16±2.37**49.36

结果表明玉叶金花苷酸甲酯的中、高剂量能显著减轻二甲苯致炎小鼠的耳肿胀度（P＜0.05），且高剂量的作用优于阿司匹林，低剂量则作用不显著，提示玉叶金花苷酸甲酯中高剂量有良好的抑制急性炎症的作用。

4.2镇痛试验

4.2.1对醋酸引起的扭体反应的影响对于由醋酸引起的小鼠扭体反应，玉叶金花苷酸甲酯各剂量组、阳性对照组与空白组比较，有显著性差异，并呈现一定的量效关系，数据见表2，说明玉叶金花苷酸甲酯能抑制醋酸引致的小鼠扭体反应，提示该成分有较好的外周镇痛效果。

表2　对醋酸引起的扭体反应的影响（±s，n=12）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量/（g·kg-1）动物数扭体次数/（次/15min）镇痛率/ %空白对照组-12 41.41±17.79玉叶金花苷酸甲酯低剂量组0.05 12 34.67±18.30*16.28玉叶金花苷酸甲酯中剂量组0.10 12 15.08±9.21*63.58玉叶金花苷酸甲酯高剂量组0.15 12 5.58±3.92**86.52阿司匹林组0.20 12 8.00±4.29**80.68

4.2.2热板试验在小鼠热板试验中，与空白对照组相比，玉叶金花苷酸甲酯中、高2个剂量对热刺激引发的小鼠痛反应时间有明显的延长作用，数据见表3。

表3　玉叶金花苷酸甲酯热板法镇痛试验结果（±s，n=10）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

30 min 60 min 90 min空白对照组组别剂量/（g·kg-1）给药前痛阈/s给药后痛阈16.94±7.70 18.10±6.67 17.40±6.97 17.47±7.14玉叶金花苷酸甲酯低剂量组0.05 15.87±7.05 17.19±7.14 16.45±6.75 15.79±7.20玉叶金花苷酸甲酯中剂量组0.10 16.76±3.50 23.56±3.92*28.68±4.28**19.23±4.80玉叶金花苷酸甲酯高剂量组0.15 14.06±4.53 19.76±5.25 30.89±3.44**17.94±4.80阿司匹林组0.20 12.50±2.71 20.02±4.73 30.34±5.15**-16.67±3.53

4.3抑菌试验

4.3.1纸片扩散法实验结果两种浓度的玉叶金花苷酸甲酯水溶液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌、阴沟肠杆菌、伤寒杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌均有一定的抑制作用，数据见表4。

表4　纸片扩散法法测定抑菌效果（±s，n=5）

对照大肠杆菌供试菌株抑菌圈/mm低质量浓度0.1 g/mL高质量浓度0.2 g/mL 23.8±0.84 26.4±0.55-15.4±0.55 18.6±0.55-伤寒杆菌11.4±0.89 12.6±0.55-肺炎克雷伯菌20.8±0.84 22.4±0.55-阴沟肠杆菌17.0±1.22 20.4±0.55-金黄色葡萄球菌17.4±0.55 18.0±0.71-铜绿假单胞菌17.0±1.22 19.2±0.45-痢疾杆菌

4.3.2最低抑菌质量浓度（MIC）测定的实验结果玉叶金花苷酸甲酯对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌均有抑菌作用，其MIC分别为2.5、10、0.312 5、1.25、1.25、10、0.625 mg/mL，数据见表5。

5　讨论

5.1二甲苯致小鼠耳肿胀试验因分离得到的药量有限，抗炎动物模型仅做了小鼠耳肿胀试验，从结果看，玉叶金花苷酸甲酯中高剂量有良好的抑制急性炎症的作用，提示玉叶金花苷酸甲酯为玉叶金花药材抗炎活性的重要药效物质基础。

表5　玉叶金花苷酸甲酯最低抑菌质量浓度实验结果

5.2镇痛试验采用经典的醋酸致小鼠扭体法及热板法疼痛模型来考察玉叶金花苷酸甲酯的镇痛作用。醋酸致小鼠扭体模型是通过化学试剂刺激造成小鼠腹腔急性炎症反应，是筛选非甾体抗炎药镇痛作用的一种敏感简便的方法；热板法属于反射性测痛模型，对仅具有外周镇痛作用的非甾体抗炎药不敏感，是区分麻醉性镇痛药和非甾体镇痛药的有效模型。两个实验结果表明玉叶金花苷酸甲酯有显著的镇痛作用，其高剂量组与阿司匹林效果相当，对化学刺激疼痛实验模型及对热刺激疼痛实验模型均较敏感，提示其镇痛机制可能同时具有外周和中枢的镇痛作用，尚需要进一步实验验证。

5.3抑菌试验最低抑菌质量浓度测定的两个实验结果表明玉叶金花苷酸甲酯对供试的7种细菌具有明显的抗菌活性，抗菌谱广，无论是对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）还是革兰氏阴性菌（肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌和大肠埃希菌）都有不错的抑制效果。

纸片扩散法实验结果可见玉叶金花苷酸甲酯对7种供试菌都有一定的抑制作用，高浓度的抑菌效果强于低浓度，综合分析两个浓度的抑菌效果可知玉叶金花苷酸甲酯对痢疾杆菌的抑制效果最强，次之为肺炎克雷伯菌，对阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的抑制效果相当，对伤寒杆菌的抑制效果最弱。

玉叶金花苷酸甲酯对7种供试菌的MIC由小及大顺序为肺炎克雷伯菌（0.312 5 mg/mL）＞阴沟肠杆菌（0.625 mg/mL）＞伤寒杆菌（1.25 mg/mL）=痢疾杆菌（1.25 mg/mL）＞金黄色葡萄球菌（2.5 mg/mL）＞大肠杆菌（10 mg/mL）=铜绿假单胞菌（10 mg/mL），这与滤纸片法得到的结果不能完全吻合，其原因可能有以下几点：（1）制作滤纸片过程中，部分滤纸片没有浸泡完全，药物没有均匀地分布在每一个部分，影响了抑菌圈的结果。（2）由于MIC的测定是在得到抑菌圈实验结果才进行的，所以菌悬液多放置培养了1 d，在这1 d内，可能有细菌产生变异，如易产生耐药性变异的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和痢疾杆菌等，而对MIC的实验结果也造成一定的影响。（3）在培养细菌的时候，为了保证不污染环境，故需要在试管上盖塞子，同时又要保证细菌能够生长，所以在盖塞子的时候又要保留一丝空隙，但是在实际操作中，不可能做到每个试管的条件完全一致，故可能细菌的生长速度会因此而有所影响，最后直接影响实验结果。

［1］江苏新医学院.中药大辞典：上册［M］.上海：上海人民出版社，1986：176.

［2］南京药学院.中草药学：下册［M］.南京：江苏人民出版社，1980：1062.

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