郑舒文，白玉娥，何炎红，田有亮

(内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

沙地云杉及其近缘种遗传多样性研究

郑舒文，白玉娥，何炎红，田有亮

(内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

应用ISSR分子标记技术，对沙地云杉与近缘种的种间遗传多样性进行研究，进而分析种间的亲缘关系。试验筛选出18个引物对红皮云杉、嫩江云杉、长叶云杉、粗枝云杉、白杄云杉和沙地云杉6个种进行扩增，获得 171 条清晰谱带，其中多态性谱带131条，多态位点百分率(PPB)为77.78%。通过POPGENE32分析表明：观察等位基因数(Na)为1.7778、有效等位基因数(Ne)为1.4803、Nei′s基因多样度(He)为0.2853、Shannon多态性信息指数(I)为0.4269。采用UPGAM法聚类分析表明，6种云杉中，沙地云杉与白杄云杉亲缘关系最近，红皮云杉与嫩江云杉亲缘关系相对较近。研究结果可为云杉属的遗传评价、系统进化、物种鉴定和种间杂交育种提供参考。

云杉；ISSR；遗传多样性；亲缘关系

云杉属(Picea)为松科常绿乔木。全球约有40种，主要分布在北纬50°—60°的寒温带或冻原地带，少数分布在温带和亚热带的湿冷亚高山带上[1]；我国云杉树种分布较多，共有16种9变种，大多分布于东北、华北、西北、西南及台湾等地区[2]。云杉属植物树干高大通直，节少，材质略轻柔、结构细致，既是纤维造纸的良材，又是建筑优良用材树种。

沙地云杉(Piceamongolica)是中国稀有珍贵树种，集中成片的分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区以克什克腾旗的白音敖包自然保护区，形成了罕见的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防风阻沙、调节气候等特点，并且生存年代久远，所以被称为沙漠上的“绿宝石”和“生物活化石”[3]。多年来沙地云杉的归属和云杉属种间亲缘关系的确定成为植物分类学界争论不休的问题。沙地云杉归属问题没有得到解决，甚至严重影响了科学研究和生产实践。随着研究的深入，许多学者对云杉属植物进行外部形态特征、生理生化、同工酶测定、核型分析、分子标记等诸多方面的研究[4-7]，获得很多有价值的数据。其中为了确定沙地云杉与近缘种的遗传多样性和亲缘关系，蔡萍等[8]应用RAPD标记对沙地云杉与近缘种红皮云杉和白杄云杉的遗传多样性进行分析，讨论三者之间的遗传多样性水平的差异，探讨沙地云杉与其近缘种红皮云杉和白杄云杉之间的演化历史和亲缘关系。但是在众多研究中，与沙地云杉对比研究的云杉属植物仅限于红皮云杉和白杄云杉，而且云杉属几种树种种间的遗传多样性关系未见报道。

由于分子标记可以在DNA水平上更为清晰地反映物种间的遗传多样性。而且ISSR 标记技术相对于其他标记的优势在于简单方便：首先，不需要知道 SSR 两侧的保守序列，省去了设计引物、同位素显示、构建文库等过程；稳定性高，重复性好，多态性高；试验成本低。所以目前已被广泛用于作物遗传育种、植物品种鉴定、基因定位和遗传图谱构建等研究中[9-13]。本研究从DNA水平上着手，首次利用ISSR分子标记的方法对红皮云杉(P.koraiensis)、嫩江云杉(P.koraiensisvar.nenjiangensis)、长叶云杉(P.smithiana)、粗枝云杉(P.asperata)、沙地云杉、白杄云杉(P.mongolica)之间的遗传多样性进行分析，确定它们之间的亲缘关系。探讨云杉属树种种间亲缘关系及系统分类学地位，不仅进一步明确沙地云杉与其他云杉之间的遗传差异，更为云杉属的遗传评价、物种鉴定和种间杂交育种提供依据，云杉树种的研究也为裸子植物分子细胞遗传学方面的研究提供可行的方法和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6种云杉(红皮云杉、嫩江云杉、长叶云杉、粗枝云杉、沙地云杉、白杄云杉)种子都来自天然群落，每种云杉都是在生长最好的代表区域，抽取10个植株，并采集当年球果，分装在透明的袋子，从球果中取出种子，放在4 ℃冰箱中保存备用，试验材料的相关信息见表1。

表1 6种云杉的相关信息

1.2 试验方法

1.2.1 云杉基因组DNA提取 把保存在冰箱里的每个树种种子取出，相同的生长条件，分别培养在10个湿润的培养皿中。长出嫩叶后，把10个培养皿里的嫩叶取出，每个培养皿的嫩叶分别取1000 mg，全部装入5个2 mL离心管，每个离心管里装200 mg，研磨后放入1.5 mL离心管，每个树种50个重复，采用CTAB法，提取云杉叶片基因组DNA。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用分光光度计测定其浓度，最后UVP型凝胶成像分析仪拍照记录，筛选出DNA条带清晰的样本，在-20 ℃的条件下保存，作为PCR的模板，分析种间的遗传多样性。

1.2.2 PCR扩增体系及程序 ISSR扩增反应条件经过优化确定20 μL的PCR反应体系，其中Taq Mix 10 μL，water 8μL，10 μm引物1 μL，模板50 ng。加拿大哥伦比亚大学提供的引物序列，由上海生工生物技术有限公司合成。PCR扩增程序：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 45 s，72 ℃延伸2 min，40 个循环，最后 72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存，PCR产物在1.2%琼脂糖(每 100 mL加入2 μL核酸染料)电泳45 min，电压120 V。缓冲液是0.5×TBE，最后在UVP凝胶成像系统中拍照保存。

1.3 数据处理

对电泳图谱中清晰可见的条带进行记录，在相同的位置有条带的记做“1”，没有条带的记作“0”，建立“0-1”二元数据矩阵。采用POPGEN 32软件，计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei′s基因多样度(He)和Shannon多态性信息指数(I)。通过NTsys 2.10e软件，计算各供试材料间的相似性系数，采用UPGMA方法进行聚类分析，获得聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 引物筛选和ISSR扩增分析

利用优化的反应体系从100条ISSR引物中筛选18个条带清晰、稳定性好的引物进行分析(表2)。18个引物对长叶云杉、红皮云杉、嫩江云杉、粗枝云杉、沙地云杉、白杄云杉6种云杉共扩增出171条谱带，其中有133多态性DNA条带，多态性条带的比例的平均值是77.78%。表明6种云杉的条带多态性大。扩增条带大多在500～2000 bp之间。每个引物扩增出7～12条不等的条带，扩增条带数的平均值为9.5，多态性条带的均值为7.39。多态性百分率最高达到90.9%，最低42.86%。由图1可以看出，同一个引物下，6种云杉扩增出不同的谱带，但是可以从谱带的位置清晰地看出6种云杉在DNA上的差异。

表2 18条ISSR引物序列及其PCR扩增

1～4为红皮云杉；5～8为嫩江云杉；9～12为长叶云杉；13～16为粗枝云杉；17～20为沙地云杉；21～24为白杄云杉。 图1 引物UBC834对6个云杉种的ISSR扩增图谱

2.2 6种云杉的遗传多样性分析

观测等位基因(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei′s基因多样度(He)与Shannons信息指数(I)是度量遗传多样性水平的常用指标，运用POPGENE 32对云杉属6个种进行分析，结果见表3。长叶云杉、红皮云杉、嫩江云杉、粗枝云杉、沙地云杉、白杄云杉6种云杉种间的Na为1.7778，Ne为1.4803。由于有效等位基因数是反映群体遗传变异大小的一个指标，其数值越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀[14]。6个云杉种间有效等位基因和观测等位基因相差0.300，差值相对较小，说明等位基因在群体中分布均匀。6种被试云杉树种总的基因多样性指标He(0.2853)和I(0.4269)值相对较小，所以亲缘关系相对较近，遗传多样性不高。

2.3 遗传距离和亲缘关系的聚类分析

遗传距离是评价种间遗传变异水平的重要指标，遗传距离越小，亲缘关系越近，遗传距离越大，亲缘关系越远。通过PopGen32计算Nei′s遗传距离(D)，分析云杉属之间的遗传关系(表4)，6种云杉种间的遗传距离分布在0.1047～0.7596之间。其中沙地云杉与白杄云杉遗传距离为0.1047，距离最小，说明这2种云杉的亲缘性相对较近；长叶云杉与白杄云杉的遗传距离是0.7596，距离最大，这2个树种的亲缘性较远。红皮云杉与沙地云杉之间的遗传距离为0.5544，距离相对比较大。

表3 6个云杉种间的遗传多样性分析

利用UPGMA法构建居群遗传关系聚类图(图2)。从聚类图可见，在0.8的区分度下可分为4类；红皮云杉和嫩江云杉聚为一类，沙地云杉和白杄云杉聚为一类，粗枝云杉和长叶云杉各为一类。在0.71的区分度下可分为3类：红皮云杉、嫩江云杉、沙地云杉、白杄云杉聚为一类，粗枝云杉、长叶云杉各为一类。根据种间遗传一致度、遗传距离和聚类分析指出，在6种被试云杉中沙地云杉与白杄云杉亲缘关系最近。

表4 6种云杉种间遗传一致度和遗传距离

*：上三角为遗传一致度；下三角为遗传距离；1～6分别为长叶云杉、红皮云杉、嫩江云杉、沙地云杉、白杄云杉、粗枝云杉。

3 结论与讨论

ISSR分子标记探讨植物种间的亲缘关系已有较多的报道[9-15]。目前，ISSR 标记已广泛应用于植物物种鉴定、指纹图谱、遗传多样性、基因定位及分子生态学研究。Scheepers D等[15]用160条引物对9个挪威云杉群体的180个个体进行RAPD分析，其中156条引物扩增出998条带，平均每条引物扩增出6.4条RAPD带，78(7%)条扩增带是多态的。蔡萍等[8]应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对内蒙古沙地云杉8个居群及其近缘种红皮云杉10个居群、白杄云杉10个居群的遗传多样性进行了研究，所用的16个随机引物在28个居群中共检测到172个位点，平均每个引物扩增带数为10.75条，其中多态位点119个，占69.19%，表现出丰富的RAPD多态性。本研究从100个ISSR引物中筛选出18条有效引物，扩增出171条条带，平均每个引物扩增出9.5条，其中多态性条带133条，占77.78%。说明ISSR标记比RAPD标记稳定性高，能扩增出更多的遗传多态性位点；而且ISSR多态性检测效率更高，表明遗传多样性参数较大，多态性位点比例在亲缘关系较近的云杉种内较高，适合亲缘关系较近的种群间遗传多样性分析。本文结果指出，6种被试云杉树种总的基因多样性指标He(0.2853)和I9(0.4269)值相对较小，说明6种被试云杉种间遗传多样性也相对较小。

蔡萍等[8]运用沙地云杉与近缘种红皮云杉和白杄云杉遗传多样性的RAPD分析，对沙地云杉、红皮云杉和白杄云杉的Nei′s多样性指数和Shannon′s多样性指数进行分析，得出8个沙地云杉居群、10个红皮云杉居群和10个白杄云杉居群间具有一致的变异趋势。根据遗传距离和聚类分析，3种云杉聚为3大类，沙地云杉与白杄云杉的亲缘关系较与红皮云杉近，表明经过漫长的进化，沙地云杉产生了较大的遗传变异，因此支持将沙地云杉划分为独立种。本试验通过ISSR标记对云杉属的6个种云杉的扩增结果表明，种间的遗传距离在0.1047～0.7596之间，说明云杉种间的遗传多样性丰富。根据遗传一致度、遗传距离和聚类分析进一步说明沙地云杉和白杄云杉的亲缘性较近，而与红皮云杉较远。

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The Interspecific Geneticdiversity ofPiceamongolicaand its Relative Species

ZHENG Shu-wen，BAI Yu-e，HE Yan-hong，TIAN You-liang

(ForestryCollege，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010019，Neimenggu，China)

The interspecific genetic diversity and relationship ofPiceamongolicaand its relatives was studied by ISSR molecular marker technology.18 primers were selected for amplification inPiceakoraiensis，P.koraiensisvar.nenjiangensis，P.smithiana，P.asperata，P.meyeriandP.mongolica.171 clear bands were obtained among which 131 were polymorphic，and percentage of polymorphic loci (PPB) was 77.78%.The result showed that observed number of alleles (Na) was 1.7778，effective number of alleles (Ne) was 1.4803，Nei′s gene diversity (He) was 0.2853，and Shannon polymorphism information index(I) was 0.4269.The cluster analysis showed thatPiceamongolicahad a close phylogenetic relationship toPiceameyeri，andPiceakoraiensishad a closer phylogenetic relationship toP.koraiensisvar.nenjiangensisin 6 spruce species.The experiment provided a theoretical basis for genetic evaluation，systematic，species identification and interspecies hybridization ofPicea.

Piceamongolica；ISSR；genetic diversity；phylogenetic relationship

2014-09-21；

2014-10-27

国家自然科学基金项目(31160166)；内蒙古农业大学灌木树种新品种选育科技创新团队

郑舒文(1990—)，女，辽宁本溪人，内蒙古农业大学林学院硕士研究生，从事森林培育理论与技术的研究。E-mail：eliane150@163.com。

何炎红。E-mail：hyh20012008@imau.edu.cn。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.03.005

S791.18

A

1002-7351(2015)03-0024-05