徐杨璐，赵胜男，刘素丽，李守拙

(承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室，承德 067000)

黄芩主产于河北、山西、陕西、内蒙古等地，是我国常用中药材之一，已有悠久的用药历史。该药为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，其性苦味寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效[1]。品种、产地、采收期及贮存期等条件不同导致中药材质量产生差异，影响其制剂质量稳定性。已有文献对不同品种、产地、采收期黄芩中的主要成分进行了研究[2-5]，但不同贮存期对黄芩药材的化学组分及其质量有无影响，笔者尚未见报道，也没有针对黄芩贮存时间相应的国家标准，导致保存多年的黄芩药材还在市场上流通。这些药材可能因为虫蛀、变色、霉变等，使药材中的化学成分比例或者成分种类产生变化，使药材品质降低，影响其安全性和有效性。因此应科学有效地控制药材贮存期，保证得到效果好、质量高的中药材。笔者采用目前广泛应用的液质联用技术[6-11]对不同贮存期黄芩进行研究，以黄芩中6种黄酮类化合物作为含量测定指标，分别考察了贮存 0，1，3，6，12，18，24个月其含量变化情况及其稳定性，以期全面有效合理地评价并控制不同贮存期黄芩的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 6310系列液相色谱-质谱联用仪(安捷伦公司):6310质谱仪，1100 Series高效液相色谱仪;HC-2062高速离心机(科大创新股份有限公司);Mettler AG245分析天平(梅特勒-托利多有限公司，十万分之一天平);KQ-700型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 对照品黄芩苷(批号:715-9506，含量 ＞98%)、黄芩素(批号:111595-200604，含量 ＞98%)、汉黄芩素(批号:111514-200403，含量＞98%)均购自中国食品药品检定研究院，汉黄芩苷(批号:20090319，含量 ＞98%)、白杨素(批号:090518，含量 ＞98%)、千层纸素A(批号:20091124，含量＞98%)均购自上海顺勃生物工程技术有限公司;甲醇、乙腈(Fisher Scientific公司)为色谱纯;甲酸、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。

黄芩样品采自河北省承德地区，药材产地由课题组人员亲自考察，药材由中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室周世良研究员鉴定为正品黄芩。将药材采用完全随机分组法分成7批，置于室温条件下，分别于0，1，3，6，12，18，24 个月取样测定。

2 方法与结果

2.1 液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS)条件

2.1.1 LC条件 色谱柱为 Agilent Zorbax XDB-C18柱(2.1 mm ×150 mm，3.5 μm);流量0.2 mL·min－1;进样量2 μL;柱温25℃;检测波长276 nm;流动相为0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)，平衡时间为 10 min，梯度洗脱，洗脱程序如下:0～10 min，18%→20%B;→18 min，20% →25%B;～30 min，25% →30%B;～40 min，30%→40%B;～60 min;40%→60%B。

2.1.2 MS 条件 离子源:电喷雾离子(electrospray ionization，ESI)源;检测方式:多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式;采用正离子模式检测;电喷雾电压3 500 V，雾化气体为氮气，雾化气压力25 psi;干燥气体为氮气，干燥气体积流量10 L·min－1;离子源温度350℃;碰撞气体为高纯氦气。6种成分的MS参数见表1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素对照品各适量，精密称定，置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，作为混合对照品贮备液。精密量取混合对照品贮备液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素浓度分别为 1 772，465，52，104，8，8 μg混合对照品溶液。

表1 6种成分的MS参数Tab.1 MS parameters of six ingredients

2.2.2 供试品溶液的制备 称取黄芩粉末约0.25 g，置平底圆底烧瓶中，精密加入溶剂(水∶乙醇∶乙酸乙酯∶冰醋酸=50∶49∶5∶1)25 mL，称定，加热回流90 min，静置放冷，再次称重，用溶剂补足减失的质量，12 000 r·min－1(r=5.5 cm)离心10 min，取上清液过孔径0.45 μm微孔滤膜稀释10倍，作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察 精密量取不同体积混合对照品溶液，用甲醇定量稀释，制得7种不同质量浓度的混合对照品溶液，按上述LC-MS条件进样测定，记录色谱图。以对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性关系考察，结果见表2。

表2 6种成分的线性关系考察结果Tab.2 Linear relations of six ingredients

2.4 精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液适量，按上述LC-MS条件连续进样6次，测定峰面积。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素的 RSD 分别为 1.8%，2.4%，0.94%，1.1%，2.0%，1.2%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验 取同一份黄芩样品0.25 g，共6份，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按上述LC-MS条件进样测定，计算各成分的含量。结果，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素含量的平均值分别为 8.19%，0.52%，1.84%，0.51%，0.04%，0.05%，RSD 分别为 2.3%，1.5%，1.7%，1.3%，2.5%，1.1%，表明方法重复性良好。

2.6 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12 h进样测定峰面积。结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素的 RSD 分别为 1.86%，2.23%，1.67%，2.14%，1.95%，2.68%。表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定。

2.7 加样回收率实验 精密称取同一黄芩样品0.125 g，共6份，分别精密加入一定量的混合对照品贮备液，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，照上述LC-MS条件进样测定，计算加样回收率，结果见表3。

2.8 样品含量测定 取各贮存期的黄芩样品，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，照上述LC-MS条件进样测定，记录峰面积，分别计算各样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素的含量，结果见表4。

2.9 结果 由实验结果可知，黄芩苷在贮存1个月含量明显下降，贮存1～3个月含量略呈上升趋势，贮存3～18个月含量变化不大;汉黄芩苷贮存1个月内含量明显下降，贮存1～6个月含量稳定，贮存6～18个月含量略呈下降趋势;黄芩素贮存0～3个月含量下降，贮存3～6个月含量上升，贮存6～18个月含量略呈下降趋势;汉黄芩素贮存0～3个月含量下降，贮存3～18个月含量不稳定，但变化不大;白杨素和千层纸素在黄芩中的含量很低，贮存0～18个月整体含量变化不大。

3 讨论

黄酮类成分中含有酚羟基，如果采用中性流动相会有拖尾现象，尤其是黄芩苷，因此需在流动相中加入少量酸抑制其拖尾现象，笔者在流动相中加入0.1%甲酸，峰形得到很好改善。黄酮苷元类化合物在正负离子模式都有高灵敏度的响应，但正离子模式一般稍好于负离子模式[12]。因此测定黄芩中的黄酮类成分采用正离子模式。

中药是一个复杂体系，要体现其多组分、多层次、多靶点的作用特点，本实验初步研究贮存18个月的黄芩中6个黄酮类化合物含量变化情况，从结果中可以看出贮存前3个月黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素含量整体呈下降趋势，4～18个月它们含量变化都不明显。笔者将继续跟踪贮存24个月后黄芩中6种黄酮类化合物的含量变化，以确定黄芩中主要成分含量明显变化的时间，同时采用植物遗传(DNA)分析、红外光谱分析、植物代谢组学分析等技术对黄芩药材中的化学组分进行分析，不断完善黄芩的质量标准。此外，中药材的质量好坏应该以其临床疗效为最终的评判标准，不一定含量高疗效就好，此实验也为揭示临床用药标准与疗效之间的关系打下了基础。

表3 6种成分加样回收率实验结果Tab.3 Results of recovery tests of six ingredients n=6

表4 不同贮存期黄芩中6种成分的含量Tab.4 Contentsofsix ingredientsin Scutellaria baicalensis Georgi with different storage period %

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