孔凡惠　脱建波　魏娇等

摘要：中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的衣壳蛋白（Coat protein，CP）及富含半胱氨酸蛋白（Cysteine-rich protein，CRP）基因，并将其连接到原核表达载体pEHISTEV，转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导，表达出分子量均为19 kD的CP和CRP。将二者从凝胶中切下，乳化后免疫新西兰大耳兔4次，获得了两种蛋白的多克隆抗体。ELISA检测表明，CWMV CP和 CRP抗血清的效价分别为1∶4096和1∶2048。Western blot分析证明该抗血清只与感染CWMV的小麦有特异性反应，而与健康或感染小麦黄花叶病毒的小麦无反应。利用含T3启动子的引物通过RT-PCR扩增出CWMV RNA2全长片段，经T/A克隆连接到pMD18-T，获得质粒pMD18-T-CWMV-RNA2。该质粒经Xba Ⅰ线性化后，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，转录产物摩擦接种本氏烟，15℃培养3天后，利用Western blot可从接种叶片中检测到瞬时表达的CWMV CP蛋白。

关键词：中国小麦花叶病毒；衣壳蛋白（CP）；富含半胱氨酸蛋白（CRP）；抗血清制备；侵染性克隆

中图分类号：S188+S435.121.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0006-05

Abstract Chinese wheat mosaic virus （CWMV） is a furovirus transmitted by Polymyxa graminis and induces soil-borne wheat mosaic disease. It has caused severe damage to winter wheat production in Yantai and Weihai of Shandong Province. The coat protein （CP） and cysteine-rich protein （CRP） genes of CWMV Yantai isolate were amplified by RT-PCR and cloned to prokaryotic expression vector pEHISTEV. The resultant plasmids were transformed into the competent cells of E. coil Rosetta. After induced with IPTG， both plasmids expressed protein with molecular weight of 19 kD. The New Zealand rabbits were immunized four times with CP and CRP cut from SDS-PAGE respectively， and the polyclonal antibody of the two proteins were obtained. The titers of antisera against CWMV CP and CRP were 1∶4096 and 1∶2048， respectively. In the Western blot assay， the antisera showed specific positive reaction only with wheat plants infected by CWMV， but not with those infected by WYMV or healthy ones. The full-length RNA2 of CWMV was amplified via RT-PCR with primer containing T3 promoter， and was linked to pMD18-T to produce the plasmid of pMD18-T-CWMV-RNA2. This plasmid was linearized with Xba Ⅰ and used as template for in vitro transcription with T3 RNA polymerase. The in vitro transcription product was mechanically inoculated to Nicotiana benthamiana leaves， and a band specific for CWMV CP was detected from the inoculated N. benthamiana leaves after three days.

Key words Chinese wheat mosaic virus （CWMV）； Coat protein （CP）； Cysteine-rich protein （CRP）； Antiserum preparation； Infectious clone

多粘菌传播的病毒病是我国小麦上的重要病害，在我国部分地区发生严重[1]。目前在我国发生较重、由多粘菌传播的小麦病毒主要有小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）和中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）[2]，其中CWMV主要在山东威海和烟台等地发生。CWMV属于帚状病毒科（Virgaviridae）真菌传杆状病毒属（Furovirus）[3，4]，寄主范围较窄，自然条件下仅侵染小麦，通过摩擦可侵染苋色黎、昆诺黎和本氏烟等[5]。小麦土传花叶病毒发生显症的适宜温度为4～15℃，当气温上升至20℃及以上时，病害发展受到抑制，新叶出现隐症，但下部老叶仍然有明显的症状[6，7]。endprint

CWMV病毒粒子杆状，基因组由两条单链正义RNA组成，5′-端均具有帽子结构。RNA1全长为7 147 nt，含有3个开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码两个分子量分别为153 kD和212 kD的复制相关蛋白和移动蛋白（Movement protein，MP）。RNA2全长为3 569 nt，也含有3个ORF，分别编码19 kD的衣壳蛋白（Coat protein，CP）、84 kD的衣壳蛋白通读蛋白（Coat protein-readthrough，CP-RT）及19 kD的富含半胱氨酸蛋白（Cystein rich protein，CRP）[4，8，9]。

本研究利用原核表达的CP和CRP蛋白制备了抗血清，并获得了RNA2的侵染性克隆。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 感病样品 CWMV病样采自山东烟台自然发病的小麦植株，通过机械摩擦接种保存在本氏烟（Nicotiana benthamiana）上。

1.1.2 质粒与菌株 原核表达载体pEHISTEV由英国圣安德鲁斯大学刘焕庭惠赠，大肠杆菌菌株DH5α和Rosetta由本实验室保存。

1.1.3 酶及试剂 克隆载体pMD18-T、反转录酶、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP、无RNase水均购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京全式金公司；羊抗兔IgG购自Sigma公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.1.4 引物 根据本实验室测定的CWMV序列设计引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因扩增及原核表达载体构建 利用TransZol法提取感病小麦叶片总RNA，以引物CWMV-RNA2-R 进行反转录，利用引物CWMV-CP-F和CWMV-CP-R扩增CWMV CP基因，引物CWMV-CRP-F和CWMV-CRP-R扩增CWMV CRP基因。CP基因经1%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化回收后用NcoⅠ和SalⅠ 双酶切，与同样酶切处理的pEHISTEV在4℃连接过夜。CRP基因经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，与同样酶处理的pEHISTEV在4℃过夜连接。连接产物转化DH5α。将PCR验证和酶切鉴定的阳性克隆进行测序分析，确定所得克隆阅读框正确。

1.2.2 蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析 将测序证明正确的阳性克隆转化大肠杆菌Rosetta。挑取单菌落接种于3 mL含50 mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，次日按1∶100稀释到20 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、220 r/min培养，至OD600值达0.4～0.6，加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L，于25℃、150 r/min继续培养5 h。12 000 r/min离心10 min，收集菌体，加入适量pH 8.0 TE溶液，振荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min，-20℃冰浴5 min，12 000 r/min离心10 min后进行SDS-PAGE电泳。

1.2.3 特异性抗血清的制备及效价的测定 用SDS-PAGE对原核表达产物进行分离，经12%聚丙烯酰胺分离胶、5%聚丙烯胺浓缩胶电泳后，用冰的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取乳白色的目的条带，按1∶1（W/V）加入0.9%生理盐水在预冷的研钵中研磨，依据梯度稀释牛血清白蛋白为参照进行SDS-PAGE。采取皮下多点注射免疫新西兰大耳兔，初次免疫用等体积的弗氏完全佐剂乳化，之后改用弗氏不完全佐剂，共免疫4次。第一次免疫剂量为1 mg，之后每隔一周进行加强免疫，免疫量为0.6 mg，从第3次开始每次免疫后7 d耳缘静脉取血，效价达到要求后心脏取血，分离血清，-80℃保存备用。

利用ACP-ELISA法[10]测定所制备抗血清的效价：在液氮中充分研磨感病小麦样品，分别按1∶10（W/V）的比例加入抗原包被缓冲液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6），并以此为抗原包被酶联板，以按同样方法处理的健康小麦叶片作为阴性对照。制备的抗血清按1∶25～1∶214进行梯度稀释。显色后用酶标仪读取450 nm的OD值，I（待测样品读数-空白读数）/H（阴性样品的读数-空白读数）≥3为阳性反应。

1.2.4 Western blot分析抗血清特异性 提取感染CWMV的小麦叶片蛋白，参照Towbin等[10]的方法，Western blot分析抗血清特异性。以烟台地区CWMV侵染的小麦样品为检测样品，健康小麦样品及WYMV侵染的小麦样品为阴性，样品于SDS-PAGE电泳后电转至NC膜上，于5%脱脂奶粉4℃封闭过夜后，对应加入适量所制备CWMV抗血清，经孵育、洗涤后，在碱性磷酸酯酶缓冲液中加入羊抗兔IgG（1∶5000稀释），在NBT/BCIP显色系统下显色至条带清晰，随后用蒸馏水终止反应，观察结果。

1.2.5 CWMV RNA2体外转录实验 利用含T3启动子的引物CWMV-RNA2-F与CWMV-RNA2-R一步扩增CWMV RNA2全长片段，经T/A克隆连接到pMD18-T，获得质粒pMD18-T-CWMV-RNA2。重组质粒经XbaⅠ线性化后，直接作为体外转录模板，体外转录参考试剂盒方法进行，体系为：5×T3 buffer 10 μL，100 mmol/L DTT 5 μL，rUTP、rATP、rCTP（均为20 mmol/L）各1.25 μL，20 mmol/L rGTP 0.32 μL，5 mmol/L Cap analog 5 μL，RRI 0.5 μL，T3 polymerase 3 μL，线性化DNA 1 μg，加DEPC-H2O到总体积50 μL。37℃孵育1.5 h后，体外转录产物与等体积的GKP buffer混合后接种于提前置于15℃下处理的本氏烟上。接种后3天通过Western blot检测其在本氏烟中的瞬时表达情况。endprint

2 结果与分析

2.1 CWMV CP基因及CRP基因克隆与序列分析

利用引物对CWMV-CP-F/CWMV-CP-R和CWMV-CRP-F/CWMV-CRP-R，从感病小麦叶片总RNA中扩增到530 bp的CP基因片段和521 bp的CRP基因片段。将PCR产物纯化回收后，分别用NcoⅠ和SalⅠ、BamHⅠ和SalⅠ双酶切，克隆到同样酶切处理的pEHISTEV载体中，获得重组质粒pEHISTEV-CWMV-CP和pEHISTEV-CWMV-CRP。通过PCR和测序证明其开放阅读框正确。

2.2 CWMV CP与CRP的诱导表达和SDS-PAGE分析

将pEHISTEV-CWMV-CP和pEHISTEV-CWMV-CRP分别转化大肠杆菌Rosetta，经1 mmol/mL IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳。结果表明，在20 kD附近出现特异性的目的蛋白条带（图1），与预期的CWMV CP与CRP大小一致，证明CWMV CP和CRP在大肠杆菌中得到了正确表达。

2.3 抗血清效价

从凝胶中切下CP和CRP对应的条带，经乳化后免疫新西兰大耳兔，获得CWMV CP与CRP的抗血清。以感染CWMV的小麦叶片为抗原，健康小麦叶片为阴性对照，利用ACP-ELISA测定血清效价。结果表明，所得CWMV CP抗血清的效价为1∶4096，CWMV CRP抗血清的效价为1∶2048。

2.4 抗血清特异性检测

利用Western blot分析所制备抗血清的特异性，结果显示，所制备CWMV CP抗血清与CWMV侵染的小麦样品发生特异性反应，而与健康小麦或感染WYMV的小麦均无反应（图2）。所制备的CWMV CRP抗血清与CWMV侵染的小麦样品发生特异性反应，产生约19 kD的目的条带，而与健康小麦或感染WYMV的小麦样品均无反应（图3）。

2.5 CWMV RNA2体外转录实验

利用CWMV-RNA2-F与CWMV-RNA2-R扩增CWMV RNA2全长片段，经T/A克隆连接到pMD18-T，获得质粒pMD18-T-CWMV-RNA2。重组质粒经Xba Ⅰ 线性化后纯化回收。以1 μg线性化产物为模板，用Promega公司的T3 RNA聚合酶进行体外转录。利用ScanDrop测定转录产物为13.6 μg/μL，使其与等体积的2×GKP缓冲液混合，选取4～5叶期本氏烟，将30 μL转录产物均匀摩擦接种于单个叶片上，取4～5片叶进行接种。接种后的植株置于15℃培养箱培养。3天后，取接种叶片，利用所制备CWMV CP血清进行Western blot检测，结果表明，所获得的CWMV RNA2体外转录物可在本氏烟中瞬时表达（图4）。

3 结论与讨论

在自然界中，CWMY和WYMV经常复合侵染，不易直接提取CWMV的病毒粒子。本研究利用大肠杆菌表达了CWMV CP和CRP，并制备了抗血清，所得抗血清的效价分别为1∶4096和1∶2048，只与CWMV侵染的小麦样品反应，而与健康小麦和WYMV侵染的小麦样品无反应，说明获得血清效价高、特异性好，可用于Western blot及ELISA等对CWMV进行检测。构建的CWMV RNA2克隆能表达出CP。

CRP是CWMV编码的沉默抑制因子[9]。本研究制备的特异性抗血清为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。

2000年，Yamamiya等人成功构建了土传小麦花叶病毒（Soil-brone wheat mosaic virus， SBWMV）的侵染性cDNA克隆[12]，利用其体外转录物成功侵染了小麦及苋色黎。中国小麦花叶病毒和SBWMV同属于真菌传杆状病毒属，但其RNA1与RNA2核苷酸序列与SBWMV的同源性分别只有75%和63%[4]。本试验中笔者成功获得了CWMV RNA2的侵染性cDNA克隆，但还需在后期实验中进一步获得CWMV RNA1的侵染性克隆，以便利用反向遗传学技术深入研究该病毒的致病机理。

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