何晓燕，胡 月，李文欣，刘宏汉

(通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化 134002)

牛皮杜鹃(RhododendronchrysanthemumsPall.)又名高山茶、牛皮茶，是杜鹃花科、杜鹃属常绿小灌木，生于海拔1300～2500m之间的林下、林缘、高山苔原带上富含腐殖质的酸性土壤，为国家三级重点保护植物.该植物除了具有极高的观赏价值外，还具有较高的药用价值，在医药、食品等领域具有广阔的开发应用前景，叶可入药，具有抗病毒、抗氧化、抑菌、延缓衰老、降低血管脆性等作用，可用作防治高血压、脑血管破裂及动脉硬化的辅助治疗剂等[1-3].目前,国内外对牛皮杜鹃的研究主要集中在栽培、绿化方面，而对于牛皮杜鹃叶乙醇提取物抗炎镇痛作用的实验研究尚未见报道，本实验采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、甲醛致小鼠足肿胀及冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增强的实验方法来观察牛皮杜鹃叶乙醇提取物的抗炎作用，采用热板法和醋酸扭体法来研究牛皮杜鹃叶的镇痛作用，为其药用价值的开发提供一定的理论依据.

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠，雌性，体重(20±2)g,长春高新医学实验动物中心提供，合格证号：scxk-(吉) 2008-0001.

1.2 实验药品

冰醋酸，批号20120803,天津市科密欧化学试剂有限公司生产；地塞米松磷酸注射液，批号201301263,河南润弘制药股份有限公司生产；95%乙醇，批号2013108,天津市风船化学试剂科技有限公司生产；甲醛，批号20120803，沈阳市科诺精细化学品有限公司生产；二甲苯，批号20100122,辽宁新兴试剂有限公司生产；依文思蓝，批号20131208，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；羧甲基纤维素钠300-800mpa.s，批号 20100123，国药集团化学试剂有限公司生产；阿司匹林片，批号120707，哈尔滨格拉雷药业有限公司；氯化钠，批号20120716，天津博迪化工股份有限公司.

1.3 实验仪器

电热鼓风干燥箱：型号DGF30，南京实验仪器厂；高速万能粉碎机：型号FW100，北京中兴伟业仪器有限公司；智能恒温电热套：型号 ZNHW-Ⅱ，郑州长城科工贸有限公司；超声波清洗器：型号 KQ-500，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发器：型号 RE-200，上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵：型号 SHI-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司；电子天平：型号ES-C200A,湘仪天平仪器厂；精密电子天平：型号 JA2003，上海恒平科学仪器有限公司；可见分光光度计：型号 H723，上海第三分析仪器厂.

2 实验方法

2.1 牛皮杜鹃叶乙醇提取物的制备[4-5]

新鲜的牛皮杜鹃叶采于长白山，并经鉴定.将新鲜的牛皮杜鹃叶阴干置于电热鼓风干燥箱中60℃干燥3h,待干燥后用高速万能粉碎机粉碎，以药液比为1:5的比例在锥形瓶内用80%的乙醇浸泡材料1h后用超声波清洗器超声40min,然后滤出混合液，再加入5倍的80%乙醇超声40min滤出混合液，合并两次滤液.将合并液放入旋转蒸发器中提纯，待提纯结束后将提纯液放入蒸发皿中在智能恒温电热套上蒸发萃取，最终得到粉末状的提取物. 以LD50给药浓度的1/10作为高剂量组给药浓度. 用精密仪器称取乙醇提物粉末1.536g，0.768g，0.384g，加2滴0.5%羧甲基纤维素钠溶液，加水定容至100mL，制备浓度为15.36mg/mL，7.68mg/mL，3.84mg/mL的牛皮杜鹃叶乙醇提取物作为高、中、低剂量组的给药浓度，冷藏备用.

2.2 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验[6]

取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，即生理盐水组,牛皮杜鹃叶乙醇提取物高、中、低剂量组和地塞米松组，各组小鼠均按0.2mL/10g给药, 即牛皮杜鹃叶乙醇提取物高、中、低剂量组的给药剂量为0.30g/kg、0.15g/kg、0.075g/kg，地塞米松组的给药剂量为0.01g/kg，每天灌胃给药一次，生理盐水组每天灌胃给予等体积生理盐水，每天称量体重、记录饮食量、饮水量1次，连续灌胃7d.末次给药后1h，二甲苯涂于小鼠右耳两面致炎，左耳不涂，致炎后60min颈椎脱臼法处死小鼠.对齐两只耳朵沿着耳廓对称剪下小鼠两耳，用精密电子天平称量，记录肿胀度(mg)和抑制率(%).

肿胀度(mg)=右耳片重(mg)-左耳片重(mg);抑制率(%)=(空白对照组肿胀度均值-用药组肿胀度均值)/空白对照组肿胀度值×100%.

2.3 甲醛致小鼠足肿胀实验[7-8]

取小鼠50只，分组及给药剂量同2.2.末次给药后1h,于右足跖皮下注射25%甲醛0.05mL致炎1h后将小鼠颈椎脱臼法处死，沿着踝关节处对称剪下左右两足，精密电子天平称量，以左侧足为正常对照，记录肿胀度(mg)和抑制率(%).

肿胀度(mg)=右足重(mg)-左足重(mg);抑制率(%)=(空白对照组肿胀度均值-用药组肿胀度均值)/空白对照组肿胀度值×100%.

2.4 冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增强实验[9-10]

取小鼠50只，分组及给药剂量同2.2.末次给药1.5h后，尾静脉注射0.5%依文思蓝生理盐水溶液0.1mL/10g，10min后用0.7%冰醋酸0.1mL/10mg，20min后脱颈椎处死小鼠，每只小鼠腹腔注射生理盐水5mL,轻柔腹部3min,从腹腔中收集腹腔洗出液3mL(冲洗液如被血液污染则弃去不用)，1500r/min离心15min，取上清液用分光光度计，于λ=590nm处测吸光度值.

2.5 热板法实验[11-15]

取小鼠放在温度为(55±0.5)℃的热板上，记录小鼠从开始放在热板上直到第一次出现舔后足时间，在5～30s内舔后足的小鼠为合格小鼠，超出、小于或逃避跳跃者则不用.取合格小鼠50只，随机分为5组，每组10只，即生理盐水组、阿司匹林组、牛皮杜鹃叶乙醇提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组.

给药前先测定出各小鼠的痛反应，并记录小鼠第一次出现舔足的时间(s)，此为热板反应潜伏期的痛阈指标，各组小鼠均按0.2mL/10g给药, 即牛皮杜鹃叶乙醇提取物高、中、低剂量组的给药剂量为0.30g/kg、0.15g/kg、0.075g/kg，阿司匹林组的给药剂量为0.023g/kg，每天灌胃给药一次，连续给药7d，末次给药lh后测定小鼠的痛阈，并计算出痛阈的提高百分率，计算公式如下：

痛阈提高百分率=(给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值)/给药前平均痛阈值×100%.

2.6 扭体法实验[11-18]

取小鼠50只，分组、给药剂量同“2.5”，连续给药7d，末次给药后1h，每组每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液(现用现配)0.2mL，在15min之内观察并记录第一次出现扭体(腹部收缩内凹伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的时间以及15min内出现的扭体次数，计算出抑制率，公式如下：

抑制率=(对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数×100%.

2.7 数据统计分析

3 实验结果

3.1 对小鼠一般特征的影响

与给药前相比，各组小鼠生活正常，精神状态良好，饮食量、饮水量均无明显的变化，小鼠平均体重呈增长的趋势.

3.2 牛皮杜鹃叶乙醇提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

与生理盐水组比较，牛皮杜鹃叶乙醇提取物低、中、高剂量组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀均有一定的抑制作用，且较地塞米松组弱；其中高剂量组表现为极显著性差异(P<0.01)，中剂量组无显著性差异(P>0.05)，低剂量组无显著性差异(P>0.05).因此,牛皮杜鹃叶乙醇提取物有一定的抗炎作用，高剂量组作用最强(见表1).

组别给药剂量(g/kg)肿胀度(mg)抑制率(%)生理盐水组-18.6±3.43-地塞米松组0.015.2±0.47∗∗0.72低剂量组0.07518.1±3.40.027中剂量组0.1512.7±4.06∗0.037高剂量组0.39.7±2.7∗∗0.048

注：与生理盐水组比较，*P<0.05,**P<0.01.

3.3 牛皮杜鹃叶乙醇提取物对甲醛致小鼠足肿胀的影响

与生理盐水组比较，牛皮杜鹃乙醇提取物低、中、高剂量组对甲醛致小鼠足肿胀均有一定的抑制作用，且较地塞米松组弱；其中高剂量组表现为显著性差异(P<0.05)，中、低剂量组无显著性差异(P>0.05). 因此,牛皮杜鹃叶乙醇提取物有一定的抗炎作用，高剂量组作用最强(见表2).

组别给药剂量(g/kg)肿胀度(mg)抑制率(%)生理盐水组-86.5±10.4-地塞米松组0.0124±2.38∗∗0.723低剂量组0.07583.7±80.032中剂量组0.1581.4±10.60.06高剂量组0.363.4±5.37∗0.151

注：与生理盐水组比较，*P<0.05,**P<0.01.

3.4 牛皮杜鹃叶乙醇提取物对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与生理盐水组比较，牛皮杜鹃叶乙醇提取物低、中、高剂量组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加均有一定的抑制作用，且较地塞米松组弱；其中高、中剂量组表现为极显著性差异(P<0.01)，低剂量组无显著性差异(P>0.05).因此,牛皮杜鹃叶乙醇提取物有一定的抗炎作用，高剂量组作用最强(见表3).

表3 牛皮杜鹃叶乙醇提取物对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

注：与生理盐水组比较，**P<0.01.

3.5 对小鼠热板致痛反应的影响

牛皮杜鹃叶三个剂量组均能延长小鼠热板反应潜伏期，给药前后比较，三个剂量组均能提高小鼠痛阈值和痛阈百分率，尤其中、高剂量组均较阿司匹林组弱；其中高剂量组差异极为显著(p<0.01)，中剂量组差异显著(p<0.05),低剂量组无显著性的变化(p>0.05)；与生理盐水组比较，高剂量组与中剂量组能提高小鼠痛阈值和痛阈百分率，其中高剂量组能明显提高痛阈百分率，差异性极为显著(p<0.01)，中剂量组差异性显著(p<0.05)，低剂量组无显著性差异(p>0.05)(见表4).

组别给药剂量(g/kg)给药前痛阈(s)给药后痛阈(s) 痛阈提高率(%)生理盐水组-13.29±2.0315.08±0.8313.47±0.9阿司匹林组0.02312.85±1.7127.69±2.74∗#115.49±7.4低剂量组0.07512.88±1.2518.32±1.0542.23±2.7中剂量组0.1519.57±1.6738.86±3.74∗#98.56±9.6高剂量组0.319.02±2.3552.54±6.76∗∗##176.23±10.7

注：与给药前比较，*P<0.05,**P<0.01;与生理盐水组比较，#P<0.05，##P<0.01.

3.6 对小鼠醋酸扭体反应的影响

组别给药剂量(g/kg)扭体反应潜伏期(min)扭体次数(次)抑制率(%)生理盐水组- 5.54±0.7655.89±5.69-阿司匹林组0.0238.62±1.6731.33±8.54∗∗43.94低剂量组0.0754.08±0.4352.11±5.436.76中剂量组0.154.69±0.5240.56±4.1227.43高剂量组0.35.13±1.1838.56±7.50∗31.00

注：与生理盐水组比较，*P<0.05,**P<0.01.

牛皮杜鹃叶乙醇提取物三个剂量组与生理盐水组比较，均能减少小鼠的扭体次数并能提高抑制率，均较阿司匹林组弱；其中高剂量组差异显著(p<0.05)，低剂量组和中剂量组无显著性变化(p>0.05)(见表5).

4 讨论

本文通过耳肿胀实验、足肿胀实验、腹腔毛细血管通透性实验研究牛皮杜鹃叶乙醇提取物对炎症早期的抗性，结果表明，牛皮杜鹃叶乙醇提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、甲醛致小鼠足肿胀及冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增强均有一定的抑制作用，且与给药剂量呈正相关关系，即高剂量组的抗炎作用最明显(P<0.01).

疼痛是由于痛觉感受器受到刺激而产生兴奋,冲动经传入神经纤维到达大脑某些神经细胞,或中枢通路的某一水平受损时所产生的一种不舒适的感觉.疼痛会给患者带来生理和心理的折磨.同时会打乱机体内分泌系统、心血管系统和呼吸系统的正常运行,使胃肠功能紊乱,降低人们的生活质量[19].因此缓解和减轻疼痛成为现代医学研究者广泛关注的问题. 热板法可制备经典的快痛实验模型，而醋酸扭体法可以制备慢性持续疼痛模型，本文采用这两种实验模型对牛皮杜鹃叶乙醇提取物的镇痛作用进行了研究，结果表明，牛皮杜鹃叶乙醇提取物对小鼠热板致痛产生的快痛具有抑制作用，同时对小鼠慢性持续性疼痛也有抑制作用，在镇痛实验中显示镇痛作用随给药剂量的增加而增强.

因此,牛皮杜鹃叶乙醇提取物有一定的抗炎镇痛效果，但是其抗炎镇痛作用机理及有效成分的分析鉴定还有待于进一步的研究， 以期为牛皮杜鹃的进一步开发和临床应用提供更多的理论依据.