廖梓亘 陈慧

红花注射液在大鼠脑缺血/再灌注损伤中抗氧化作用的研究

廖梓亘 陈慧

目的 探讨红花注射液（SI)在大鼠脑缺血/再灌注损伤中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影响。方法 将40只健康SPrague-Dawley大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注模型组、小剂量红花组和大剂量红花组，每组10只，分别在再灌注24h测定超氧化物歧化醉(SOD)活性和丙二醛（MDA）的含量，再灌注24h后取梗死灶脑组织行HE染色。结果 小剂量红花组和大剂量红花组SOD活性较缺血/再灌注模型组及假手术组有显著增强（P＜0.05），并且大剂量红花组较小剂量红花组的SOD活性增强更明显（t=79.871,P=0.000）；小剂量红花组与大剂量红花组MDA含量较缺血/再灌注模型组及假手术组有显著减少（P＜0.05），并且大剂量红花组较小剂量红花组的MDA含量减少更明显（t=-1.314,P=0.000）。结论 红花注射液在大鼠脑缺血/再灌注损伤中通过增强机体SOD活性,降低MDA含量，达到其保护作用。

大脑中动脉闭塞；红花注射液；超氧化物歧化酶；丙二醛

急性脑缺血损伤是目前发病率高、病死率高、致残率高，严重威胁着人类健康的疾病，寻求保护方面的研究是主要目标之一。研究发现，脑缺血/再灌注损伤后产生大量氧自由基等炎性因子，从而说明氧化应激机制是脑缺血/再灌注损伤的主要机制之一。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是体内的主要氧自由基清除剂之一，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂质过氧化物产物之一，因此，通过具有清除氧自由基的药物对缺血/再灌注损伤有神经保护作用。

红花为菊科植物,具有活血通经、祛瘀止痛的功效,是传统的活血化瘀类中药,主要成分有红花苷、红花素、黄花素和总黄酮等，具有明显降低脑缺血大鼠脑线粒体MDA含量、升高SOD活性、抑制Ca2+过多摄入[1]，本研究通过观察不同剂量的红花对大鼠脑缺血/再灌注损伤后细胞形态学及SOD活性及MDA含量的影响，探讨红花对脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料 实验动物及分组 40只清洁级健康雄性SD大鼠，雌雄不限，体质量200～250g,由南华大学实验动物中心提供，许可证号：SYYK-025。本实验研究严格参照中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[2]。40只大鼠随机分成假手术组、缺血/再灌注模型组、小剂量红花组和大剂量红花组，每组10只。

1.2 方法 造模成功后2h小剂量红花组及大剂量红花组分别腹腔注射红花注射液1mL/kg和3mL/kg(山西华卫有限公司)；假手术组,缺血/再灌注模型组分别腹腔注射等量的生理盐水。实验动物模型的制备及评分参照Koizumi[3]方法制成大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模术后2h观察大鼠的症状和体征,采用Longa[4]评分标准进行。0分：正常（无神经功能障碍）；1分：上肢不能完全伸展；2分：爬行时向左侧划圈；3分：爬行时向左侧倾倒；4分：无自发性活动伴意识障碍。剔除0分与4分；符合评分标准，但有蛛网膜下腔出血、术后死亡者，亦予以剔除，并随机补充。

1.3 脑缺血再灌注后体积的测量 各组SD大鼠脑缺血模型分别在缺血2h后再灌注24h后，再次评分后，深度麻醉后并断头取脑，以视交叉和其后4mm处两点冠状切片，逐层切成2mm厚的脑片，置于2%的3，5-三苯基氯化四氮唑TTC溶液中孵育，然后固定、染色后，观察脑组织：正常脑组织呈红色，脑缺血组织呈白色。

1.4 HE染色观察 所有大鼠缺血/再灌注24h后，再次评分，断头取脑后，取得的所有脑组织均用10%中性甲醛固定，石蜡包埋,组织连续冠状切片，HE染色。

1.5 SOD活性测定 将各组大鼠经心脏取血4mL，4000r/min离心15min，取上清液30μL，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量，按试剂盒说明操作。

1.6 MDA含量测定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定。将经心脏取血4mL，离心半径为4cm,离心速度为4000r/ min离心15min，取上清100μL，采用TBA比色法测定MDA含量，按试剂盒说明操作。

1.7 统计学方法 用SPSS20.0统计软件进行统计分析。计量资料采用“x±s”表示，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红花注射液对脑缺血/再灌注损伤后的大鼠神经功能评分及脑梗死体积的影响 根据Longa评分，假手术组评分最低，无神经功能障碍；缺血/再灌注模型组评分最高，神经功能受损最严重。小剂量红花组及大剂量红花组神经功能评分与缺血/再灌注模型组比较有显著改善（P＜0.05）；大剂量红花组较小剂量红花组神经功能评分改善更显著（t=0.869,P=0.000）。小剂量红花组及大剂量红花组脑梗死体积与缺血/再灌注模型组比较，也有显著改善（P＜0.05）；大剂量红花组较小剂量红花组脑梗死体积改善也更显著（t=18.276,P=0.000）。见表1。

表1 红花注射液对脑缺血/再灌注损伤后的大鼠神经功能评分及脑梗死体积的影响(x±s，n=10)

2.2 HE染色 显微镜下可见：假手术组：神经细胞胞质深染，核仁形态正常、饱满；缺血再灌注模型组：神经细胞大量变性坏死，细胞间间隙明显增宽，细胞间质空泡改变，细胞稀少，细胞水肿明显，胞体缩小；小剂量红花组：神经细胞部分变性坏死，存活的神经细胞较多，凋亡细胞相对减少，细胞水肿明显，部分细胞形态相对正常；大剂量红花组：神经细胞少部分变性坏死，存活的神经细胞增多，凋亡细胞减少，多数细胞形态正常。见图1。

图1 大鼠脑缺血/再灌注损伤24小时脑组织病理组织变化（HE染色×400）

2.3 红花注射液对脑缺血/再灌注损伤后大鼠脑组织中SOD活性和MDA含量的影响 小剂量红花组、大剂量红花组SOD活性和缺血/再灌注模型组与假手术组相比较有显著增高（均P＜0.05）；其中大剂量红花组较小剂量红花组SOD活性增高更显著（t=79.871,P=0.000）。小剂量红花组、大剂量红花组MDA含量和缺血/再灌注模型组与假手术组相比较有显著减少（P＜0.05）；其中大剂量红花组较小剂量红花组MDA含量减少更显著（t=-1.314,P=0.000）。见表2。

表2 红花注射液对脑缺血/再灌注损伤后的超氧化物歧化酶和丙二醛的影响(x±s，n=10)

3 讨论

既往研究发现，氧化应激是脑缺血/再灌注损伤的机制之一，脑缺血/再灌注损伤后激活大量的酶性物质引发一系列信号级联反应,产生大量氧自由基，导致一系列病理生理改变。抗氧化物质不断清除体内过多的氧自由基,以保持体内内环境自由基的动态平衡，不发生自由基连锁反应和组织损伤[5]。脑缺血后，启动氧化应激机制，使得体内SOD消耗过多，MDA生成增加，动态平衡打破，导致神经细胞变性坏死进一步加重。氧化应激机制可能通过以下途径：（1）氧自由基激活炎性因子：如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）等大量释放，致使小胶质细胞被激活产生大量的炎症反应；（2）进一步损害细胞蛋白质、糖和脂肪酸等导致细胞变性坏死；（3）氧自由基还可损伤脑细胞的DNA,进而和其他机制共同作用最终导致细胞凋亡；（4）加速体内三羧酸循环代谢，更进一步增加了氧自由基的产生，造成细胞内游离Ca2+增加,钙离子超载的作用进一步增加,致上述恶性循环反复进行而加重脑损伤。

近年来的研究表明，红花注射液目前被人们所广泛认可并主要用于治疗冠心病、心绞痛、脉管炎等多种血液循环障碍疾病的治疗[6]。红花注射液具有镇痛、抗氧化、降脂、抗炎等作用，对血栓形成有一定抑制作用[7]，还可以能明显减轻由脑卒中引起的脑水肿[8]，改善血管阻力、扩张血管、增加脑部血流量、改善及增加纤维蛋白溶酶的活性、加强血栓溶解等，对血小板凝集有抑制作用，对缺氧缺血组织具有保护作用，红花注射液具有减轻脑梗死患者的神经损伤[9-10]及改善血液动力学的作用[11]。本研究结果显示，Longa评分越高，神经功能损害越严重，所以缺血/再灌注模型组评分最高，神经功能受损最严重；予以红花注射液后，评分下降明显，神经功能损害显著改善，尤其以大剂量红花组更为明显。红花注射液组脑梗死体积较缺血/再灌注模型组明显缩小，而红花注射液中以大剂量组梗死体积缩小更明显，提示红花注射液在一定剂量的范围内，剂量越大，神经功能损害及梗死体积缩小越明显。

HE染色显示，缺血/再灌注模型组的神经细胞损害最严重，细胞凋亡最明显，细胞核变性坏死最严重，相比予以红花注射液腹腔注射后，神经细胞得到一定程度的改善，细胞凋亡减少，细胞形态部分正常；而大剂量红花注射液组提示细胞形态、细胞数及核仁明显改善。结果表明，红花注射液具有保护作用，与以往结果相一致[12]。

本研究结果显示，与假手术组比较，缺血/再灌注模型组的SOD活性显著降低，MDA含量显著增高，提示氧化应激参与了脑缺血/再灌注损伤的病理生理过程，2h再灌注后24h后取血再检查，小剂量红花组及大剂量红花组SOD活性与缺血再灌注模型组和假手术组相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中大剂量红花组比小剂量红花组SOD活性增高值高，提示红花注射液能提高大鼠脑缺血血液中SOD活性。

综上所述，红花注射液对大鼠脑缺血/再灌注后，可以改善神经功能评分,改善缺血区域的供血，减少脑梗死体积方面差异均有统计学意义,使得缺血/再灌注后细胞学形态得到明显改善，神经元细胞数量明显增加，提高缺血区SOD活性和减少MDA含量，尤以提高SOD的含量显著,表明红花注射液具有较强的抗自由基作用，从而对缺血/再灌注起到保护作用。

[1] 田京伟，傅风华，蒋王林，等.羟基红花黄色素A对脑缺血所致大鼠脑线粒体损伤的保护作用[J].药学学报，2004，39(10)：774.

［2］ 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见[S]. 2006-09-30.

[3] Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al．Experimental studies of ischemicbrain edema：A new experiment model of cerebralem bolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J]．Stroke，1986，8（1）：1-8.

[4] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without Craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91．

[5] Suzuki J．Chemiluminescence in hypoxic brain[J]．Stroke，1988，19：65.

[6] 林涛．红花注射液对冠心病患者冠脉血流、抗氧化能力及脂质代谢的影响[J].重庆医学，2012，41（31）：3267-3269.

[7] 王来银.红花注射液的临床应用概况[J].中国药物经济学，2013，10(11)：66-67.

[8] 懂泽宏，佘靖.中药现代研究与应用(第三卷)[M].北京：学院出版社，1998：2057.

[9] 徐开蕾，范华昌，刘龙民，等.红花注射液颈动脉灌注治疗脑梗死的疗效及对大鼠脑线粒体影响的研究[J].中成药，2010，32（9）：1472-1476.

[10] 秦松苗.红花注射液治疗急性脑梗死疗效观察[J].中国实用神经疾病杂志，2011，14（12）：86-87.

[11] 赵欣欣，黄兰，唐发宝.红花注射液对脑梗死血液流变学影响的Meta分析[J].中国药房，2011，22（15）：1413-1415.

[12] 欧芹，魏晓东，孙鹏，等.红花黄色素对衰老模型小鼠脑细胞凋亡的影响[J].中国康复医学杂志，2006，21（6）：504.

Objective To investigate the effect of safflor injection on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury. Methods 40 healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, ischemia reperfusion model group, low dose group, large dose of safflor group, 10 rats in each group. The contents of SOD activity and MDA were measured by 24h assay, and the HE staining was performed after reperfusion 24h. Results The activity of SOD was significantly enhanced in the small dose group and large dose group (P＜0.05), and the SOD activity was significantly higher in the large dose group (t=79.871，P=0.000 ), and the MDA in the low dose group and the sham operation group (t=-1.314，P=0.000). Conclusion The effect of safflor injection on the SOD activity and the protective effect of MDA in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury was reduced.

Middle cerebral artery occlusion；Safflor injection;Superoxide dismutase；Malondialdehyde

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.35.003

湖南 421001 南华大学附属第二医院神经内科（ 廖梓亘） 广东510288 广州市中山大学孙逸仙纪念医院南院急诊科（ 陈慧）