蔡苏亚

摘 要：汞离子在我们生活中的应用较广，它的腐蚀性和致癌性较强。基于增强型荧光探针设计进行了分子检测实验研究，数据库分析表明：探针荧光的发射强度随汞离子的增加而变强； pH在4.00～7.00之间，pH值不会干扰化合物1对Hg2+的检测。结果表明：汞离子探针的高灵敏度和良好的选择性，对测定自来水和院校初级水中的汞离子浓度起到了作用，对于荧光探针的进一步改进具有参考价值。

关 键 词：探针荧光；汞离子；发射强度；pH值

中图分类号：TQ 028 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2015）09-2143-03

Abstract： Mercury ions have been widely used in our lives， but it has strong corrosion and carcinogenicity. In this paper， enhanced fluorescent probes were designed based on experimental studies of molecular detection. The database analysis shows that， the fluorescence emission intensity of the probe becomes strong with the mercury ions increasing； when pH is between 4.00～7.00， pH value of compound 1 does not interfere with the detection of Hg2+. The above results show that： the mercury ion probes have high sensitivity and good selectivity， it can be used to measure the concentration of mercury ions in water tap .

Key words： Fluorescence probe； Mercury ions； Emission intensity； PH value

探针不是一种检测工具，而是一种检测分子，该分析可以在保证被检测对象不产生或只产生可忽略的干扰的情况下，通过和某特异靶分子相互作用来检测靶分子。顾名思义，荧光探针是一种存在荧光物质的分子，这种荧光探针可以作为一种指示剂，通过一定的光的刺激使指示剂发光从而对被检测对象进行定性或定量分析[1]。荧光分析方法具有很大的优势，如较高的灵敏度，较好的选择性，所需要的样本比较少，通常主要应用在分析化学领域，如分子生物学、生物化学、医学等。但是自然界中的大量的生物分子本身不存在或存在较少的荧光物质，这就影响了检测工作的进行。因此人们采用荧光探针技术促进检测工作的顺利进行，荧光探针技术是通过能够使被检测对象产生较强荧光的方法增强荧光检测试验的，其方法是在被检测对象中加入强荧光的标记试剂、荧光生成试剂等，生成高荧光强度的共价或非共价结合的物质。汞是存在于自然界中的一种重金属元素，它的存在形式多种多样，有游离态、无机和有机汞三种状态[2]。相对于亚汞离子（Hg+），汞离子（Hg2+）在我们生活中的应用较广，它的腐蚀性和致癌性很强，具有破坏性。有机汞（尤其是甲基汞）一般通过海洋生物进入人体，这种物质一旦进入人体就会对大脑造成伤害，甚至还会出现其他的慢性疾病，日本就曾发生过因有机汞而造成大量的人感染水俣病。所以，检测汞离子在水中的含量是关系人身安全的重要举措[3，4]。检测汞离子的方法多种多样，包括原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、电化学方法以及紫外可见光谱法等[5]。但是这些检测方法都存在很大的缺陷，成本高，样本提取难度大，耗费时间长，不能进行实时和现场检测等。现在随着荧光探针的普遍应用，检测汞离子主要采用荧光探针的方法。

1 实验原理

FQ-PCR就是应用荧光探针的方法进行的，它巧妙地利用Taq酶的5 → 3外切酶活性，将荧光探针加入到PCR反应系统中，使该探针和DNA模板发生作用，进行特异性杂交，从而使探针的5端和3端组成一个能够进行能量传递的结构，其中荧光报告基团FAM存在于探针的5端，荧光淬灭基团TAMRA存在于探针的3端。在探针完整的情况下，如果荧光淬灭基团TAMRA吸收了荧光报告基团FAM所激发出的荧光信号，那么荧光信号会保持不变。PCR反应体系中有些基因会增加特异核酸片段，如目的基因，这些特异核酸片段会根据碱基配对的原则与荧光探针融合在一起。在复制过程中，Tap酶会沿着DNA模板从引物3端移动到探针结合处，移动期间，5→ 3端外切酶活性会将探针割裂，这就是切口平移效应。这就会损坏荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构，从而导致淬灭基团失去淬灭作用，荧光报告基团失去标记作用，荧光信号被释放到PCR系统外（图1）。通过观察PCR的反应，我们可以发现探针随着特异核酸片段的复制逐渐被切断，荧光信号也就相应地失去标记作用，三者是1∶1∶1的比例变化的。因为被释放的荧光基团数目和PRC产物的数目相等，所以荧光信号与扩增产物有很大的关系。另外，因为荧光信号可以将扩增产物的变化表现出来，所以即使不进行信号分离也可以完成仪器实时检测，从而为证明新的PCR定量原理奠定基础。

2 实验部分

2.1 实验设备

通常情况下，荧光测定需要荧光光谱仪，能够进行该操作的工具时Perkin Elmer LS55 荧光光谱仪，其配置为10.0 nm的激发狭缝，10.0 nm的发射狭缝；UV-2450紫外仪可以测定出紫外可见光谱；Varian INOVA-400光谱仪可以测定出核磁共振谱。

为了更好的进行实验研究，罗丹明在Alfa Aesar公司购买了一些材料，如2-氨乙基噻吩、2-氯-1-甲基碘化吡啶和4-二甲氨基吡啶等。因为大多数的化学药品是分析纯试剂，所以直接使用是可以的。而且实验中的水也都是可以进行实验的去离子水。其中实验中的水所在院校所河水，这种水只是进行了初级的过滤；自来水则是没有经过过滤的取自于2006年12月17湖南大学学生8舍自来水。

2.2 结果分析

2.2.1 荧光发射光谱图

图2是在水温为25 ℃的条件下，记录探针1在乙腈和水的体积比为1∶1的0.05 mol/L Tris-HNO3，酸碱性为6的缓冲溶液中，荧光发射光谱随Hg2+溶液浓度不断变化的图。

图2显示，当溶液中不存在Hg2 +时，580 nm的位置出现一个不太明显的荧光发射峰，它代表化合物1的变化；随着Hg2+的添加，该处的变大，与此同时，Hg2+浓度的增加会使得荧光发射强度达到最大峰值。如果Hg2+ 的浓度超过最大值，化合物1在原来位置的荧光发射强度会达到原来的14.5倍。Hg2+ 浓度的不断增加，荧光发射强度也不断扩大，说明在这个过程中化合物1与Hg2+发射了反应，这是本文测定Hg2+的含量的主要方法。

图3是探针1是有无Hg2+的紫外可见吸收光谱图。

图中显示不加入Hg2+时，在560 nm位置是化合物1出现不太明显的吸收峰，此时化合物1是罗内酰胺[274]；如果溶液中汞离子浓度为10-5 mol/L Hg2+，在560 nm的位置，化合物1的吸收峰变大，此时化合物1的罗内酰胺结构不存在了。从光谱中可以看出，化合物1中的罗内酰胺结构被打开是因为Hg2+能和化合物1作用的结果。

2.2.2 pH的影响

图4的因变量是pH值，自变量是汞离子浓度为1.0×10-5 mol/L时，化合物1荧光强度的变化。

从图中可以得出以下结论，Hg2+影响化合物1的荧光强度，如果不加入Hg2+在，其pH 处于4.00到12.00范围内；在溶液中的pH小于4.00的情况下，如果pH减小，荧光强度增加，这是因为强酸性的环境使得化合物1的罗内酰胺被打开，从而增强其荧光度。如果加入Hg2+使其浓度保持在1.0×10-5mol/L 时，化合物1的荧光强度会固定在pH 4.00～7.00范围内；在溶液中的pH大于7.00小于8.00的情况下，如果pH增加，荧光强度减小，这是因为碱性环境下，Hg2+发生了化学反应，生成Hg（OH）2，减少了Hg2+，从而减少了与化合物1的反应；在溶液中的pH处于8.00～12.00范围内时，荧光强度不会再增加，而且其强度与不存在Hg2+时是一致的。因此，如果pH在4.00～7.00之间，pH值不会干扰化合物1对Hg2+的检测。从以上分析可知，Tris-HNO3在pH为 6.00的条件下，实验效果最佳。

3 结 论

这篇文章中的荧光探针是由汞离子和罗丹明-噻吩类化合物组合而成，实验中探针荧光的发射强度岁汞离子的增加而变强，溶液的颜色也逐渐由无色变成粉红色，这就促进了Hg2+的识别。但是只有Hg2+的浓度在5×10-8～1×10-5 mol/L之间时，探针才有反应，其能够检测到的最低值是2.0×10-8 mol/L，溶液的酸碱性也在4.0到7.之间0。由于汞离子探针的高灵敏度和良好的选择性，对测定自来水和院校初级水中的汞离子浓度起到了很大的作用。

参考文献：

[1]龚毅君， 张晓兵， 谭蔚泓，等. 结构优化设计用于构建高效Hg2+荧光探针[J]. 化学传感器， 2012， 32（1）： 36-36.

[2]李静， 朱成成， 何卫江， 等. 一个基于NBD-NH2荧光团的增强型pH荧光探针及其细胞造影研究[J].无机化学学报， 2013， 29（12）： 2528-2534.

[3]王维娜， 郑元梅， 陈雪梅， 等. 一种基于DPA识别基团的可视化检测锌离子的荧光增强型探针[J].无机化学学报， 2014， 30（4）： 872-878.

[4]袁跃华， 冯锋， 田茂忠， 等. 罗丹明类荧光探针的合成及对铜离子的检测[J]. 高等学校化学学报， 2011， 32（1）： 62-66.

[5]李宏林， 樊江莉， 刘晓健， 等. 罗丹明类钯离子荧光分子探针[J].高等学校化学学报， 2010， 31（9）： 1725-1728.