郭洹铭，赵日明，王 锦，蔺万煌

(1.湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，湖南长沙 410128; 2.湖南农业大学理学院，湖南长沙 410128)

吲哚-3-乙酸分子印迹聚合物的合成及吸附性能分析

郭洹铭1，赵日明1，王 锦2，蔺万煌1

(1.湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室，湖南长沙 410128; 2.湖南农业大学理学院，湖南长沙 410128)

以吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)为模板、甲基丙烯酸为功能单体、乙腈为致孔剂，采用本体聚合法合成了对IAA有特异性识别的吲哚-3-乙酸分子印迹聚合物(IAA-MIP)。红外光谱分析表明，IAA是以氢键形式结合在聚合物的空腔中。等温吸附线及Scatchard分析表明，洗脱模板后的IAA-MIP结合IAA的能力比空白印迹聚合物(NIP)强，且有2种结合方式，其解离常数分别为KD1=1.04×10-6mol·L-1和KD2=9.23×10-6mol·L-1，最大表观结合位点分别为Bmax1=0.10μmol·g-1和Bmax2=0.28μmol·g-1。对植物样品的固相萃取实验表明，洗脱模板后的IAA-MIP对IAA具有较强的特异性吸附能力。

吲哚-3-乙酸;分子印迹聚合物;本体聚合;固相萃取;吸附性能

分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)是指以某一特定的分子为模板，制备对该分子具有特异选择吸附性聚合物的过程［1］。该聚合物称为分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer，MIP)。当模板分子与聚合物单体接触时就会形成多重作用位点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，去除模板分子后的聚合物在分子结构上形成了与模板分子空间构型匹配且具有多重作用位点的空间，这样的空间将对模板分子或其类似物有选择性识别的特性［2］。因为MIP具有选择性吸附的功能，在天然产物分离纯化、固相萃取、生物传感器、药物分析和膜分离技术［3-7］等领域被广泛应用。

吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)是植物体内一种重要的植物激素，参与植物体内多种生理生化过程的调控，对植物生长发育具有十分重要的作用，植物样品中IAA的高效提取和精确测定对于研究其在植物生命活动中的调控作用具有非常重要的意义［8-10］。但是IAA在植物体内含量很少，每克鲜样仅含10～100 ng，而且在光和空气中易分解。传统的植物激素分析测试方法都需要对样品进行冷冻干燥、粉碎等前处理，并经有机溶剂提取、分离纯化后才能进行相应测定，且对植物样品的需求量很大，冻干样品需要约0.5 g以上［11］。为减少植物样品的用量，作者采用本体聚合法［12-13］合成了吲哚-3-乙酸分子印迹聚合物(IAA-MIP)，并对其特异吸附性能进行了探讨，拟为植物样品中IAA的高效吸附分离提供帮助。

1 实验

1.1 试剂与仪器

二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，分析纯，Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.;乙腈，色谱纯，Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd.;甲基丙烯酸(MAA)、吲哚-3-乙酸、偶氮二异丁腈(AIBN)、甲醇、无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

FTIR-680型傅立叶变换红外光谱仪，美国Perkin Elmer公司;LC-9A型高效液相色谱仪、UVmini-1240型紫外可见分光光度计，日本岛津公司;RCT-60型真空冷冻离心机，法国Jouan公司。

1.2 IAA-M IP的合成

准确称取IAA 0.7 g，量取3 mL功能单体甲基丙烯酸，将两种物质加入30mL致孔剂乙腈中充分混合，超声波处理10 min;然后加入15 mL二甲基丙烯酸乙二醇酯与250 mg引发剂偶氮二异丁腈，混匀，通氮气10 min后抽真空并密封，50℃ 水浴避光反应24 h;反应完成后，取出白色固体，研磨，过筛(孔径为75 μm)，然后用丙酮沉降，去除细小颗粒;沉降后加入50 mL甲醇与乙酸(体积比9∶1)的混合液，摇床中振荡(5 h×3次);再加入50 mL甲醇摇床中振荡(5 h×3次)，在索氏提取器中用甲醇提取至提取物中检测不到IAA，烘干，备用。

与上述制备条件完全相同，仅不加模板分子制备空白印迹聚合物(NIP)。

1.3 红外光谱检测

将IAA-MIP、洗脱模板后IAA-MIP和NIP分别与KBr混合(质量比1∶100)，研磨均匀，进行红外光谱检测［14］。

1.4 等温吸附线与Scatchard分析

分别称取0.1 g洗脱模板后的IAA-MIP与NIP粉末放入 2组离心管中，分别加入 1μmol·L-1、2μmol·L-1、4μmol·L-1、6μmol·L-1、8μmol· L-1、10μmol·L-1的IAA乙醇溶液10 mL，以加入不含IAA的无水乙醇10 mL作空白对照。放入25℃的恒温摇床中振荡12 h，再在25℃下静置12 h，取上清液测定218 nm波长处吸光度。考察洗脱模板后IAAMIP、NIP对不同浓度IAA的吸附情况，绘制等温吸附线，并进行Scatchard分析［15］。

1.5 对植物样品的固相萃取

分别称取0.5 g洗脱模板后的IAA-MIP与NIP粉末装于3 mL的固相萃取空柱中，再依次加入乙腈、去离子水，烘干柱子，备用。

准确称取3 g拟南芥新鲜植物样品，使用液氮研磨后加入50 mL预冷的80%甲醇，浸提过夜，3 000×g离心，取上清液，浓缩，用无水乙醇定容至10 mL。

取2 mL拟南芥提取液加入1 mL 0.1 mol·L-1的IAA乙醇溶液中，以无水乙醇定容至10 mL制成上样液;同时另取拟南芥提取液2 mL，不加IAA标准溶液，仅以无水乙醇定容至10 mL作为对照上样液。分别将上样液与对照上样液加入制好的洗脱模板后的IAAMIP与NIP固相萃取小柱中，收集萃取液;再加入9 mL乙醇进行淋洗，收集淋洗液;最后加入9 mL甲醇-乙酸混合液(体积比9∶1)进行洗脱，收集洗脱液;浓缩，分别配制成1 mL的乙醇溶液进行HPLC检测。按下式计算IAA样品回收率:

HPLC检测条件如下:检测波长218 nm，流速0.8 mL·min-1，柱温35℃，梯度洗脱条件见表1。

表1 HPLC梯度洗脱条件Tab.1 The condition of HPLC gradient elution

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析(图1)

图1 IAA-M IP(a)、洗脱模板后IAA-M IP(b)及NIP(c)的红外光谱Fig.1 FTIR Spectra of IAA-M IP(a)，IAA-M IP removed temp late(b)and NIP(c)

图1a在3 446.63 cm-1处出现羧基的O-H伸缩振动吸收峰，而图1b、c中O-H的伸缩振动吸收峰出现在3 454.82 cm-1和3 454.59 cm-1处。这是因为，IAA-MIP中羧基上的-OH与功能单体MAA上的-COOH产生了氢键作用力［16］，O-H伸缩振动吸收峰发生红移;而洗脱模板后的IAA-MIP中无模板分子，O -H吸收峰又恢复到了3 454.82 cm-1处，与NIP中O -H的伸缩振动吸收峰基本保持一致。表明，IAA与MAA是以氢键方式结合在IAA-MIP的空腔中，索氏提取后IAA-MIP中IAA被完全洗脱。

2.2 等温吸附线与Scatchard分析

为了研究洗脱模板后的IAA-MIP对IAA的吸附特性，计算出洗脱模板后的IAA-MIP与NIP对不同浓度IAA溶液的吸附量Bbound，绘制等温吸附线，结果见图2。

图2 洗脱模板后IAA-M IP与NIP的等温吸附线Fig.2 Adsorption isotherm of IAA-M IP removed template and NIP

由图2可看出，洗脱模板后的IAA-MIP对不同浓度IAA的吸附能力明显比NIP强。

根据Scatchard方程可得:

式中:c为IAA浓度;KD为聚合物的平衡解离常数;Bmax为最大表观结合位点。

以Bbound/c对Bbound作图，结果见图3。

图3 IAA-M IP的Scatchard分析图Fig.3 Scatchard analysis of IAA-M IP

由图3可看出，Bbound/c和Bbound并非是很好的线性关系，表明MIP与IAA的结合位点并不是等价的［17］;但是图中的前后两部分却分别显示出了良好的线性关系。这表明IAA-MIP存在2种不同的结合位点。

根据2条直线的斜率及截距可求得低结合力结合位点的KD1=1.04×10-6mol·L-1、最大表观结合位点Bmax1=0.10μmol·g-1;高结合力结合位点的KD2= 9.23×10-6mol·L-1、最大表观结合位点Bmax2=0.28 μmol·g-1。

2.3 对植物提取液中IAA的吸附情况

分别将拟南芥样品的萃取液、淋洗液、洗脱液浓缩后配制成1 mL的乙醇溶液进行HPLC检测，结果见图4。

图4 植物提取液中IAA的HPLC图谱Fig.4 HPLC Chromatograms of IAA from plant extraction liquid

由图4可看出:上样液分别经过洗脱模板后的IAA-MIP小柱与NIP小柱后，萃取液中IAA的含量分别为7.94%和37.55%(图4a);洗脱模板后的IAAMIP淋洗液与 NIP淋洗液中 IAA的含量分别为13.09%和29.30%(图4b);洗脱模板后的IAA-MIP洗脱液与NIP洗脱液中IAA的含量分别为62.64%和 32.16%(图4c);植物样品提取液中其它成分上柱后全部流出，洗脱液中无相关吸收峰出现。表明，洗脱模板后的IAA-MIP对IAA有较强的选择吸附能力，对其它成分几乎不吸附。增大洗脱液的极性及酸度，被吸附的IAA与其它成分分离后能有效地被洗脱回收。

3 结论

采用本体聚合法合成了IAA-MIP。红外光谱分析表明，IAA是以氢键形式结合在IAA-MIP空腔中;Scatchard分析表明，洗脱模板后的IAA-MIP与IAA具有2种结合方式，其解离常数分别为KD1=1.04×10-6mol ·L-1和KD2=9.23×10-6mol·L-1，最大表观结合位点分别为Bmax1=0.10μmol·g-1和 Bmax2=0.28μmol ·g-1。使用洗脱模板后的IAA-MIP对植物提取液中的IAA进行固相萃取，结果表明，洗脱模板后的IAAMIP对IAA具有较强选择吸附性，可实现植物提取液中IAA的分离，对于样品中复杂植物激素分析具有良好的应用前景。

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Synthesis and Adsorption Property of Indole-3-Acetic Acid M olecular Im printed Polymers

GUO Huan-m ing1，ZHAO Ri-m ing1，WANG Jin2，LIN W an-huang1
(1.Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.College of Sciences，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

Using indole-3-acetic acid(IAA)as template andmethacrylic acid as functionalmonomer and acetonitrile as porogen，indole-3-acetic acid molecular imprinted polymers(IAA-MIP)that had specific recognition to IAA were synthesized by bulk polymerization.Infrared spectroscopy indicated that IAA was hydrogen bonded in the cavity of the polymers.Adsorption isotherm and Scatchard analysis showed IAA-MIP removed template had higher affinity to IAA than non-imprinted polymers(NIP).There were two binding modes between IAA-MIP and IAA，the dissociation constants were KD1=1.04×10-6mol·L-1and KD2=9.23×10-6mol·L-1，themaximum apparent binding capacity were Bmax1=0.10μmol·g-1and Bmax2=0.28μmol·g-1.Experiments of solid-phase extraction from plant sample solutions showed IAA-MIP removed template had specific adsorption ability for IAA.

indole-3-acetic acid;molecular imprinted polymer;bulk polymerization;solid-phase extraction;adsorption property

O 658

A

1672-5425(2015)02-0036-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2015.02.009

国家自然科学基金资助项目(91317312);湖南省高校创新平台开放基金资助项目(11K032)，湖南省研究生科研创新项目(CX2012B286)

2014-10-31

郭洹铭(1987-)，男，陕西西安人，硕士研究生，研究方向:植物激素与生长发育，E-mail:king_cat_guo@163.com;通讯作者:蔺万煌，教授，E-mail:linwhat@163.com。