张智星， 冯祥礼， 毛 靖△， 肖建中， 邱进俊， 刘承美

1华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心，武汉 430030

2湖北省中医院口腔科，武汉 430061

3华中科技大学材料科学与工程学院，武汉 430079

4华中科技大学化学学院，武汉 430079

可注射骨修复材料的骨组织反应评价＊

张智星1， 冯祥礼2， 毛 靖1△， 肖建中3， 邱进俊4， 刘承美4

1华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心，武汉 430030

2湖北省中医院口腔科，武汉 430061

3华中科技大学材料科学与工程学院，武汉 430079

4华中科技大学化学学院，武汉 430079

目的 研究自制的可注射骨修复材料植入兔股骨缺损区后的骨组织反应特点。方法 选用25只新西兰大白兔，在其双侧股骨内髁制作标准骨缺损区模型，分别注射不饱和聚磷酸酯／β－磷酸三钙复合物（UPPE／β－TCP）和添加1%四环素的UPPE／β－TCP复合物（UPPE／β－TCP／TTC），按2、4、8、12、24周的植入期分为5组，对骨组织样本进行组织病理学和形态学观察，并比较各期植入体的吸收率。结果 在各植入期内，UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC两种复合物的骨组织反应基本一致。植入2周时，所有材料和周围骨组织均未发生明显的吸收或改建，植入体未引起周围骨组织的炎性反应和坏死；4周时植入体与骨缺损区结合良好，无纤维结缔组织囊形成，在材料发生吸收而改建的区域，可见成骨细胞、新生血管和活跃的新骨形成；8周时大部分植入体仍存在于骨缺损区内，部分植入体成为“独岛”被完全整合进入新生的骨组织中；12周时骨组织有广泛的重建；24周时植入体主体部分消失，骨组织内的生长和改建更加活跃，新生骨和骨髓样组织中可见大量材料碎片，并可见成骨样细胞。2种复合物植入骨缺损区后的吸收率均随植入时间的延长而逐渐增加，在8周以前其吸收率相似（P＞0.05），而12周时UPPE／β－TCP／TTC复合物组的吸收率高于UPPE／β－TCP复合物（P＜0.05），24周时2种复合物的吸收率均在60%以上。结论 可注射骨修复材料UPPE／β－TCP复合物在动物体内具有良好的骨组织生物相容性、生物可降解性和体内骨引导性，可作为修复骨缺损的新型复合材料。

β－磷酸三钙； 不饱和聚磷酸酯； 骨缺损； 骨修复； 吸收率

引导骨组织再生的经典方法是使用骨移植物修复骨缺损。目前，自体骨的成骨性和再生能力仍被认为是骨移植材料的金标准，但取骨时的创伤及自体骨移植后可能发生的吸收等缺陷限制了其在引导骨组织再生治疗中的应用。使用异体骨移植也是修复骨缺损的一种常用方法，但实际的骨再生效果在研究中存在较大的争议［1］，因此，组织工程材料仍是目前引导骨组织再生的研究热点，其基本原理是将可生物降解的聚合物支架充填入骨缺损区，作为细胞粘附和增生、分化的临时居所，缓慢降解后即可为新生的骨组织所替代［2］。本课题组已自行研制成功用于骨修复的新型控释性可生物降解聚合物材料——不饱和聚磷酸酯（unsaturated polyphosphoester，UPPE），且前期已对UPPE聚合物及不饱和聚磷酸酯／β－磷酸三钙复合物（UPPE／β－TCP）的理化性能、体外可降解性和体外细胞毒性等方面进行了检测，证明其具有良好的生物安全性、生物相容性、药物控释性、可注射性和可降解性［36］，有望用作引导骨组织再生工程材料。本研究旨在评价这种新型可注射骨修复材料——UPPE／β－TCP复合物——植入兔体内的骨组织反应，以明确材料处于体内动态环境时的生物学变化和行为，评价其在动物体内的生物学相容性、生物可降解性和生物学有效性，为进一步深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 可注射骨组织修复材料的制备方法

1.1.1 UPPE／β－TCP复合物的制备 UPPE和β－TCP颗粒（100目）均由华中科技大学合成。将1.0 g UPPE完全溶解在0.48 g交联剂N－乙烯基吡咯烷酮（N－vinyl pyrrolidone，NVP）中，然后混入0.018 g促进剂N，N－二甲基苯胺，接着加入2.5 g氯化钠和1.0 gβ－TCP搅拌均匀形成糊剂；另取0.22 g NVP加入0.006 g过氧化苯甲酰引发剂形成溶解液。上述各制剂组分均经环氧乙烷消毒，使用前将2份试样放入无菌容器中混合，搅拌均匀后，迅速用无菌注射器注入已制备好的标准骨质缺损模型中，待其在常温下发生交联反应10 min后，即形成交联的UPPE／β－TCP复合物骨植入体。

1.1.2 含1%四环素（tetracycline，TTC）的UPPE／β－TCP复合物的制备 TTC为分析纯，购自Sigma公司（St.Louis，MO，USA）。同法制备UPPE／β－TCP糊剂，使用时按重量比在糊剂中添加1%的TTC，迅速用无菌注射器注入已制备好的标准骨质缺损模型中，待其在常温下发生交联反应10 min后，即可形成含1%TTC的UPPE／β－TCP交联复合物（UPPE／β－TCP／TTC复合物）植入体。

1.2 实验动物分组及处理方法

本动物实验由华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物研究中心批准，严格遵循“中华人民共和国实验动物管理条例”中的规定对实验动物进行饲养、管理和使用。

选择25只骨骼发育成熟的4～5月龄雄性新西兰大白兔，体重约为3.5 kg，将其分别单独饲养在不锈钢笼中，自由进食和饮水，要求每只动物在实验前在本实验动物中心有至少7 d的饲养期，以适应新环境。将所有大白兔按2、4、8、12、24周的植入期分为5组，每组5只，选择股骨内侧髁，左右随机选择注射UPPE／β－TCP复合物和UPPE／β－TCP／TTC复合物，共在骨组织中注射50个复合物样本，为预防术后感染，每只均在术前和术后24 h内肌肉注射20万单位的青霉素。

实验动物手术方法按体重0.1 m L／kg的剂量用0.5%戊巴比妥钠行耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定，取股骨下端的内侧作为术区。备皮后碘伏消毒，在股骨远中内侧作2～3 cm长的切口，纵向切开膝关节内侧的皮肤、皮下组织，分离骨膜，暴露股骨内侧髁，在生理盐水持续冷却的条件下用牙科种植机以不超过450 r／min的转速由内向外在内侧髁制备约2 mm的洞型，再用直径逐渐增大（2～4 mm）的骨钻逐级将洞型扩大，最后形成直径为4 mm、深为6 mm的圆柱形骨质缺损区，挖匙去尽骨质碎屑，生理盐水冲洗，充分止血后在左右侧缺损区随机注射UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC两种复合物糊剂，注射时应采取从底部向表面逐级后退的方式。等待约10 min，材料完全固化后去除多余的材料，无菌生理盐水冲洗，分层严密缝合骨膜及软组织（图1）。

1.3 观察分析指标

手术后需密切观察动物的饮食、活动和伤口愈合状况等。分别在植入术后2、4、8、12、24周将动物麻醉处死，完整切取复合物植入体与周围的组织，大体观察复合物与周围组织的融合情况及骨组织形成情况后，再将样本置于10%的缓冲型甲醛溶液中固定24 h，置于25%的EDTA溶液中脱钙，50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐级梯度脱水，二甲苯浸泡脱脂，石蜡包埋，垂直于植入体长轴切取5μm左右的切片，每个样本至少取3个切片，苏木素－伊红（HE）染色，光镜下观察骨缺损区材料及其周围与宿主骨结合部的组织学反应和成骨情况，并使用图像分析软件（Image－Pro Plus Version 4.5，MediaCybernetics Inc.，MD，USA）对各时期植入骨缺损区材料的吸收率进行测量，测量方法如下:植入体吸收率＝（原植入体的横截面积－剩余植入体的横截面积）／原植入体的横截面积×100%。

图1 动物模型的建立Fig.1 Establishment of the animal model

1.4 统计学分析

实验结果以¯x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对结果进行统计学分析，应用单因素方差分析进行组间的均数比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

所有实验动物均在术后约1 h苏醒，饮水及进食情况正常，行动正常，在股骨缺损植入区周围未出现明显不良反应，如材料暴露、皮肤溃疡、术区感染化脓等，伤口愈合良好，无骨折发生及意外死亡情况。

在移植术后2、4、8、12、24周时分别取材，并用低速金刚砂锯垂直于植入体长轴切开股骨缺损区，肉眼观察骨质缺损区的愈合情况，结果显示: UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC两种复合体修复骨缺损的大体外观表现基本一致，在各个植入期均未引起周围组织的炎症反应和坏死，图2为UPPE／β－TCP复合物植入体样本各期的大体外观，可见植入2周后，植入体基本维持其原来的形状，且与骨缺损区结合致密，在植入体与骨组织间无纤维囊形成；植入4周后，植入体表面均有骨组织生长，与材料结合较好，但植入体开始降解，外形变得不规则；植入8周后，骨质缺损区有块状骨组织形成；12周后，植入体与骨组织的界限已不甚明显，新形成的骨组织切面呈黄白色，质地较硬；24周后，植入体主体已基本消失，新生骨质与周围骨组织紧密结合，界限无法分辨。

图2 股骨缺损区植入UPPE／β－TCP复合物后各期的大体外观Fig.2 Cross－sectional photographs showing medial condyle of femur after implantation of UPPE／β－TCP composite at different time points

2.2 组织病理学观察

在各个植入期内，2种复合物植入体的组织学反应基本相同，均可见骨组织与材料界面处无纤维组织囊插入，材料逐渐降解，骨缺损区内无炎性细胞存在。图3为UPPE／β－TCP／TTC复合物植入体术后不同时间的组织病理学检查:在2周时，材料和周围的骨组织均未发生明显的吸收或改建，植入体周围的骨组织无炎性反应及坏死，骨组织与植入体之间未发生明显的反应，材料与骨组织交界处的骨小梁与植入体结合紧密（图3A）；植入4周后，由于降解而出现的植入体材料孔隙中及其与骨缺损区交界处开始有新骨形成，新生骨组织钙化状况良好，与材料结合良好，无纤维结缔组织囊形成，在材料发生吸收而改建的区域，可见成骨细胞和活跃的新骨形成、新生血管（图3B）；8周之后，大部分植入体仍存在于骨缺损区，而部分植入体成为“独岛”被完全整合进入新生的骨组织中，两者交错缠结在一起，“独岛”中可见成骨样细胞（图3C）；12周时骨组织有广泛的重建，网状新生骨开始充填骨缺损区，可见板层骨结构，并出现大量的新生血管为新骨供应营养（图3D）；24周后，植入体主体部分消失，为新生骨或骨髓样组织替代，新生骨组织结构变得致密（图3E）。

图3 UPPE／β－TCP／TTC复合物植入术后各期的组织病理切片图（苏木精－伊红染色，×100）Fig.3 Histopathological images of UPPE／β－TCP／TTC composite after implantation at different time points（HE staining，×100）

2.3 复合物植入体的吸收率

图4为UPPE／β－TCP复合物和UPPE／β－TCP／TTC复合物植入股骨缺损区后各时期的吸收率，可见两组复合物的吸收率均随植入时间的延长而逐渐增加，在8周以前其吸收率相近，组间的差异无统计学意义（P＞0.05），而12周、24周时UPPE／β－TCP／TTC复合物组的吸收率高于UPPE／β－TCP复合物，其间的差异具有统计学意义（均P＜0.05），且24周时两种复合物植入体的吸收率均在60%以上。

图4 UPPE／β－TCP复合物和UPPE／β－TCP／TTC复合物植入骨缺损区后各时期的吸收率Fig.4 Resorption rate of UPPE／β－TCP composite and UPPE／β－TCP／TTC composite after implantation at different time points

3 讨论

一种生物材料是否可用作骨替代物，在对骨替代物进行体外检测合格后，一般还要进行动物实验，以便从组织病理学、组织形态学等方面进行评价，获得骨替代物的成骨性和骨整合性等各项特征，对材料的生物相容性进行完整、真实的评价［78］。骨移植物的作用是给骨缺损区提供支持、充填缺损区并促进骨的生物学修复。目前，许多材料均可引导骨组织的再生，虽然都能够取得一定的效果，但仍有许多问题亟待解决，如材料植入体内后的机械稳定性和生物相容性、材料在体内降解期间所造成的局部或全身炎症反应、材料是否具有骨传导或骨诱导等生物学活性、以及释放抗生素以改善抗感染效果的能力等［2］。

TTC除具有众所周知的抑菌活性外，还具有抗炎、抗胶原酶活性及阻止骨吸收等生物学特性［910］，添加TTC后的骨替代物可以在局部控释TTC药物以控制炎症、防止微生物感染和改善骨修复效果。本课题组前期已对UPPE／β－TCP复合物的体外细胞毒性和成骨细胞的活性等进行了研究，结果显示UPPE／β－TCP复合物的宏观结构和机械性能符合作为骨替代物的要求，本研究则旨在评价这种新型控释性可注射骨修复材料UPPE／β－TCP复合物植入实验动物骨组织后的体内生物学相容性，以及添加TTC后对股骨缺损区修复的影响。动物模型的建立采用在兔股骨中形成直径4 mm、深6 mm的缺损然后植入骨替代材料的方法，此方式被广泛用于评价骨组织工程研究的骨组织形成情况［1112］。两种复合物材料（UPPE／β－TCP和UPPE／β－TCP／TTC）均使用注射器从底部直接注射入骨缺损区内，这样不但可防止产生气泡，而且同时可使植入体与周围骨组织紧密结合，防止植入体／骨组织界面处纤维结缔组织的插入，促进骨组织的愈合。本实验结果也证实了此注射方法充填骨缺损区的优势，即肉眼可见两种复合物均成功地与动物模型中的骨缺损区发生直接接触，并在一定的时期内维持其原来的形状，作为充填物与骨缺损区形成骨整合，未发生组织排斥和明显的移位现象，符合其他学者关于优异复合材料骨组织反应的研究结果［13］。

同时，本研究的组织病理学和组织形态学结果证明:两组复合体植入后均未引起骨缺损区的炎性反应，表明其具有良好的体内骨组织相容性。植入2周后，复合体均基本维持其原来的形状，与骨缺损区结合致密，在植入体与骨组织间无纤维囊形成，说明复合物的固化未受骨髓腔中血管出血的影响；植入4周后复合体发生明显的降解，新生骨组织在材料与骨缺损区交界处沉积，并向材料内部生长，证明材料具有较好的骨引导性，且随着植入期的延长，材料的吸收率逐渐增加；12周后UPPE／β－TCP／TTC复合物组的吸收率高于UPPE／β－TCP复合物，表明UPPE／β－TCP／TTC复合物所释放的药物加速了骨组织的重建和材料的降解，但在长达24周的体内生物降解过程中，复合物植入体周围的骨组织中均未发生明显的炎性反应，表明其降解产物也具有较好的生物相容性。因此，可注射骨修复材料UPPE／β－TCP复合物在动物体内具有良好的骨组织生物相容性、生物可降解性和体内骨引导性，有望作为修复骨缺损的新型复合材料。

［1］ Burkhardt R，Lang N P.Fundamental principles in periodontal plastic surgery and mucosal augmentation－－a narrative review［J］.J Clin Periodontol，2014，41（Suppl.15）:S98－S107.

［2］ Scheller E L，Krebsbach P H，Kohn D H.Tissue engineering: state of the art in oral rehabilitation［J］.J Oral Rehabil，2009，36（5）:368－389.

［3］ Qiu J J，He Z X，Liu C M，et al.Crosslinking property of an oligomeric unsaturated phosphoester used as a potential injectable biomaterial［J］.Biomed Mater，2008，3（4）:044107

［4］ 张智星，毛靖，冯祥礼，等.具有控释性能的可注射牙槽骨修复材料中β－磷酸三钙的体外细胞毒性研究［J］.华中科技大学学报:医学版，2008，37（4）:544－546.

［5］ Zhang Z，Mao J，Feng X，et al.In vitro cytotoxicity of polyphosphoester as a novel injectable alveolar replacement material［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog［Med Sci］，2008，28（5）:604－607.

［6］ Zhang Z，Feng X，Mao J，et al.In vitro cytotoxicity of a novel injectable and biodegradable alveolar bone substitute［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，379（2）:557－561.

［7］ Khaled E G，Saleh M，Hindocha S，et al.Tissue engineering for bone production－stem cells，gene therapy and scaffolds［J］.Open Orthop J，2011，5（7）:289－295.

［8］ Raftery R，O’Brien F J，Cryan S A.Chitosan for gene delivery and orthopedic tissue engineering applications［J］.Molecules，2013，18（5）:5611－5647.

［9］ Gamal A Y，Kumper R M，Gendy A R.Doxycycline－loadedβtricalcium phosphate release following EDTA root surface etching improved the clinical outcomes in chronic periodontitis:an in vivo study［J］.J Periodontol，2013，84（7）:924－933.

［10］ Susin C，WikesjöU M.Regenerative periodontal therapy:30 years of lessons learned and unlearned［J］.Periodontol 2000，2013，62（1）:232－242.

［11］ Ginebra M P，Espanol M，Montufar E B，et al.New processing approaches in calcium phosphate cements and their applications in regenerative medicine［J］.Acta Biomater，2010，6（8）: 2863－2873.

［12］ Link D P，van den Dolder J，van den Beucken J J，et al.Bone response and mechanical strength of rabbit femoral defects filled with injectable CaP cements containing TGF loaded gelatin microparticles［J］.Biomaterials，2008，29（6）:675－682.

［13］ Dreifke M B，Ebraheim N A，Jayasuriya A C.Investigation of potential injectable polymeric biomaterials for bone regeneration［J］.J Biomed Mater Res A，2013，101（8）:2436－2447.

（2015－01－26 收稿）

In Vivo Bone Tissue Response to an Injectable Bone Substitute

Zhang Zhixing1，Feng Xiangli2，Mao Jing1△et al
1Department of Stomatology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2Department of Stomatology，Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China

Objective To assess in vivo bone tissue response to an injectable bone substitute after implantation using a rabbit model.Methods Twenty－five male New Zealand white rabbits were used as experimental animals.The unsaturated polyphosphoester／β－tricalcium phosphate composite（UPPE／β－TCP）and UPPE／β－TCP composite containing 1%tetracycline（UPPE／β－TCP／TTC）were injected in circular defects as created in the femoral condyles of rabbits and were left in place for 2，4，8，12 and 24 weeks.The specimens were evaluated morphologically（histology and histomorphometry）and absorption rate of implant at different time points was compared.Single factor analysis of variance and Tukey’s multiple comparison tests were used to determine statistical significance of results.Results At different implantation stages，gross examination of retrieved implant／bone composite samples indicated that the UPPE／β－TCP composite and UPPE／β－TCP／TTC composite did not evoke inflammatory response，necrosis or fibrous encapsulation in surrounding bony tissues.Histological examination revealed excellent composite／host bone bonding.At 4 weeks，resorption induced voids between terminals of bone defects and implants were largely filled with new bone.Composite resorption，new blood vessels，osteocytes，osteons and osteoblast－like cells lining up with active new bone were observed at remodeling sites.At 12 weeks，a new bone network was developed within femoral defect，while composite became islands incorporated in the new bone.At 24 weeks，bone ingrowth and remodeling activities became so extensive that the interface between residual cement and new bone became less identifiable.In general，the resorption ratio values increased with implantation time.Conclusion These results showed that UPPE／β－TCP composite holds promise for use as a synthetic biodegradable scaffolds for tissue engineering.

β－tricalcium phosphate； unsaturated polyphosphoester； bone defects； bone repair； resorption ratio

R336

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.010

＊国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（No.2006AA03Z0443）

张智星，男，1972年生，医学博士，主治医师，E－mail:262856134＠qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:maojing＠hust.edu.cn