付红梅 王寅旭 王晓明 罗家明

IL-17F及IL-17A基因多态性与中国四川汉族人群多发性硬化的相关性

付红梅 王寅旭 王晓明 罗家明

目的 探讨中国四川汉族人群中白细胞介素(interleukin, IL)-17A多态位点rs2275913及IL-17F基因多态位点rs763780与多发性硬化(multiple sclerosis, MS)发病的相关性。方法 收集川北医学院附属医院神经内科就诊的MS患者126例，以176名性别年龄相匹配的健康体检者为对照，利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法来检测rs2275913及rs763780多态位点的等位基因及基因型频率分布，并进行统计学分析。结果 MS患者IL-17F基因rs763780位点TT基因型频率(84.92%)高于健康对照组(71.01%)，差异有统计学意义(校正后P=0.036)。患者T等位基因频率(92.06%)亦高于正常人(84.66%)，差异有统计学意义(校正后P=0.048)。MS患者IL-17A位点rs2275913的基因型频率及等位基因频率与健康对照者相比无统计学差异(P>0.05)。结论 IL-17F基因多态位点rs763780与MS相关，TT基因型及T等位基因可能是中国四川汉族人群MS发生的危险因素。IL-17A位点rs2275913同四川汉族人MS发病无相关。

多发性硬化；白细胞介素-17；多态性,单核苷酸

多发性硬化(multiplesclerosis,MS)是一种伴有轴突损伤、神经退行性变、由T细胞介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，系欧美国家青年致残的常见病。近年来，中国MS发病率也呈逐年递增趋势。MS的发病机制尚未完全阐清，可能与遗传易感性、自身免疫及环境因素等多种因素相关。其中，遗传易感性是极为重要的机制[1]。近年来国内外不断有研究表明白细胞介素(interleukin,IL)-17F和IL-17A基因多态在炎症性疾病中起重要作用[2-4]。其中IL-17F多态位点rs763780具有生物学功能，是IL-17的天然拮抗剂，并被证实同视神经髓鞘炎等脱髓鞘疾病相关[2]。而IL-17A多态位点rs2275913同样被证实在亚洲人群中同炎性反应性疾病相关[4]。目前国内对IL17多态与MS的关系则较少报道。本研究对IL-17F多态位点rs763780及IL-17A多态位点rs2275913同中国四川地区MS发病的相关性进行了探讨。

1 对象和方法

1.1 临床资料 选取2009-06-2012-09在川北医学院附属医院神经内科就诊的MS患者126例，所有患者均依据修订后2005年McDonald标准[5]评估临床体征，并结合实验室检查及影像学检查结果确诊。其中男38例、女88例，年龄22～68岁，平均年龄(40.9±7.2)岁，均为四川籍汉族人。对照组为至川北医学院体检中心进行常规体检的健康者，其中男56名、女120名，年龄27～67岁，平均年龄为(41.2±6.3)岁，对照组也均为四川汉族人。所有对照人员同患者无血缘关系，并经详细询问病史，排除自身免疫病史、肿瘤病史、感染病史、家族疾病史以及其他神经系统疾病史。该研究经川北医学院附属医院伦理委员会批准。所有参与本研究的患者和健康人均被书面告知研究内容并签署知情同意书。两组年龄及性别比较差异无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1DNA抽提：抽取所有研究对象外周静脉血5mL，置于EDTA抗凝管内，储存于-20℃冰箱内备用。采用QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen,Valencia,CA) 试剂盒，根据标准提取说明抽提全DNA，提取完成的DNA按体积稀释10倍后作为工作浓度存放于4℃冰箱备用。

1.2.2 基因多态性分析：PCR反应引物利用PrimerPremier5软件设计，由上海英潍捷基(Invitrogen)生物公司合成。IL-17F位点763780所用引物为：F：5′-GGGAATGCAAACAAACACCTGAA-3′，R：5′-CCGTTCCCATCCAGCAAGAGA-3′，所用限制性内切酶为：HSP92II(Fermentas, 美国)。IL-17A位点rs2275913所用引物为：F：5′-GCATAACTCTTCTGGCAGCTGTA-3′，R：5′-TGCCCACGGTCCAGAAATAC-3′，所用限制性内切酶为：XMNI(Fermentas, 美国)。PCR反应体系包括：每管内DNA模版1μL、10μmol/L上下游引物各0.2μL、去核酸酶水2μL(Promega，美国)、PreMixTaqDNA聚合酶3μL(Promega，美国)，总体积约6μL。PCR反应热循环条件为：95℃预变性5min，进入扩增阶段后，变性时间改为30s，IL-17F位点rs763780退火温度为60℃，IL-17A位点rs2275913退火温度为58℃，退火时间均为30s；延伸温度为72℃，时间为30s；此阶段循环36次后，进行5min72℃的延伸。PCR反应所采用仪器为ABI公司生产的VerityPCR扩增仪。在每5μL扩增出的PCR产物中加入2u限制性内切酶，于37℃条件下孵育6h以上。完成酶切后的PCR产物加入3%(质量浓度)琼脂糖凝胶(Biowest，西班牙)，Goldview染色，250V电压下完成电泳分离后，利用Bio-Rad凝胶成像仪检测分型结果。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计学分析。MS患者和正常人的等位基因及基因型频率先采用χ2检验，然后进行Bonferroni校正检验；临床症状及神经系统损伤定位等临床表型与基因型的相关性进行分析采用Fisher精确概率法；健康对照组的基因频率分布进行哈迪温伯格平衡检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1IL-17位点同MS的相关性分析 所有纳入的研究对象均分型成功，对照组的基因频率分布均未偏离哈迪温伯格平衡，表明样本来源的人群具有群体代表性。两组基因及等位基因分型见表1及表2。MS患者组携带T等位基因频率及TT基因型频率均高于健康对照组(校正后P=0.048，OR=2.102，95% CI=1.224～3.611；校正后P=0.036，OR=2.298, 95%CI=1.278～4.131)。而两组间IL-17A多态位点rs2275913的基因型和等位基因频率的分布并无统计学差异(P> 0.05)。

2.2MS患者临床表型同IL-17位点的相关性分析MS组中脑脊液寡克隆带阳性患者占66.7%(84/126)，周围运动神经症状阳性78.6%(99/126)，感觉神经症状55.6%(70/126)，共济失调55.6%(70/126)，动眼神经症状8.7%(11/126)，视觉损害19.8%(25/126)，构音障碍4.8%(6/126)。MRI检查结果所示损伤部位在幕上占94.4%(119/126)，幕下占54.0%(68/126)，脑桥占35.7%(45/126)，小脑占23.0%(29/126)，脊髓占62.7%(79/126)。利用Fisher确切概率法对临床症状与IL-17多态位点的相关性，以及神经系统损伤的定位分布与IL-17多态位点的相关性进行分析，结果显示各临床症状与IL-17的两个多态位点基因型及等位基因频率无相关性(P>0.05)，神经系统损伤部位的分布同IL-17位点亦无相关性(P>0.05)。

表 1 两组IL-17F 位点rs763780基因型及等位基因的分布

表 2 两组IL-17A位点rs2275913基因型及等位基因的分布

3 讨论

本研究结果显示，MS患者中IL-17F的多态位点rs763780的TT基因型频率高于健康对照，同时MS患者中rs763780的T等位基因频率相较健康对照也明显有增高。而IL-17A多态位点rs2275913同中国四川汉族人群中MS的发生则无明显相关。以往研究认为MS是由Th-1细胞介导的炎性反应性疾病，但最近的研究结果表明该疾病的发生和发展中有一类新的效应T细胞支系即Th-17细胞系参与。针对MS患者的脱髓鞘瘢痕的病理研究显示IL-17阳性细胞频率明显高于健康者。这一现象的原因可能是Th-17细胞转移至中枢神经系统后，激活并聚集大量非特异性炎性反应细胞，识别并破坏髓鞘抗原，从而导致脱髓鞘改变[6]。同时在MS动物模型中也发现Th-17细胞对中性粒细胞有诱导和聚集作用，并且驱动未成熟单核细胞进入血循环，单核细胞、巨噬细胞等迅速增殖并向受损部位迁移，吞噬坏死组织、髓鞘抗原而变为吞噬细胞，最终导致组织损害和脱髓鞘改变[7]。

目前为止，大量证据表明MS的发病机制同炎性反应细胞因子以及T细胞配体如IL-6等基因的多态性显著相关[8]。最近研究发现的IL-17家族在多种炎性反应细胞如T细胞、成纤维细胞以及外周血单个核细胞的激活过程以及树突状细胞的熟化过程中起关键作用。IL-17家族共有6种配体蛋白，其中IL-17F及IL-17A均定位于6p12染色体，具有60%以上的核苷酸序列相同[9]。并且在多种炎性反应相关疾病中表现出的蛋白表达形式也极为相似。

IL-17F位点rs763780为错义突变，位于IL-17F基因编码区第三外显子，纯合子状态下可导致组氨酸被精氨酸替换而导致蛋白质改变。Kawaguchi等[2]的研究结果表明该位点同哮喘病相关，并且证实该位点致氨基酸改变后，IL-17F即不能从分裂素的途径激活蛋白酶从而影响细胞因子的表达。Seiderer等[10]在德国的炎性反应性肠病患者中发现肠局部IL-17F的mRNA水平较健康者高。本研究结果表明IL-17F多态位点rs763780的TT基因型同MS呈显著相关。这同日本人群中进行的该位点和溃疡性结肠炎、哮喘等疾病的相关性研究的结果具有相似性[2,4]。同时值得注意的是，本研究结果同Wang等[3]进行的IL-17F在中国南方人群中视神经髓鞘炎发病相关性的研究结果一致，此结果进一步提示rs763780可能与IL-17神经脱髓鞘作用相关。然而该位点的T等位基因作为易感基因型在基因座中占多数，在健康者中也有携带却并未导致正常人发生MS，由此表明：(1) MS作为一类复杂的遗传疾病，其遗传模式为多基因共同作用，单一基因在遗传异质性不同的个体上的表达并不统一，因此IL-17F位点同MS的相关性虽可能是其发病的重要因素之一，但并不能完全解释MS的发病机制[1]。(2) IL-17F所触发的众多下游炎性反应因子在不同个体以及全身不同位置的表达强度及持续时间有较大差异[2]。

本研究并未发现IL-17A位点rs2275913同中国四川汉族人群MS发病相关。Ramsey等[11]对欧洲哮喘患者进行了IL-17A的多态扫描，并未发现IL-17A同欧洲哮喘患者相关。Shibata等[12]对日本的皮炎患者的研究中也并没有发现IL-17A多态位点同该病的相关性。Shu等[13]曾尝试探讨IL-17A位点是否同中国汉族Behcet’s病患者相关，结果也表明该位点并未显著影响该疾病的发生。这些结果表明，即使是同类疾病，在不同种族之间，IL-17通路在发病机制中所起的作用也截然不同。本研究中IL-17A多态位点rs2275913同中国四川汉族人群MS发病并没有显著相关，原因可能为：(1)尽管rs2275913位于IL-17A基因上游，可能接近或位于启动子区，而并未引起氨基酸改变，因此未能影响IL-17A表达的水平。(2)rs2275913可能与其他有功能的、未知的多态位点有连锁关系，而并不作为一个独立因素参与MS的发病。(3)各研究的样本量大小不同，因此可能需要进一步验证本位点的确切作用。

通过Fisher确切概率法对IL-17的两个多态位点的基因型及等位基因频率同MS患者临床症状如共济失调、视力损害和构音障碍等临床特征的相关性进行分析，结果显示IL-17位点并未同MS患者的临床表型相关。根据MRI扫描结果记录所示的患者神经系统损伤位置的分布探讨其损伤分布频率是否同IL-17多态位点相关。分析结果并未发现MS患者神经损伤的定位分布同IL-17位点有显著相关。提示IL-17多态位点与MS的发生相关，但是同临床症状的出现没有明确的相关性。

在MS的发病机制中，遗传易感性是极为重要的一环，遗传易感性也是该类自身免疫病研究的热点问题。本研究发现IL-17F多态位点rs763780的TT基因型及T等位基因在中国四川汉族MS患者中明显高于对照组，其多态位点rs763780基因型TT及T等位基因与中国四川汉族人群中MS的发病有显著相关，表明IL-17F可能是MS的易感基因。IL-17A多态位点rs2275913则与中国四川汉族人群MS发病无明显相关。

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(本文编辑：时秋宽)

Association of interleukin-17F and interleukin-17A gene polymorphisms with multiple sclerosis in a Sichuan Han population

FUHongmei,WANGYinxu,WANGXiaoming*,LUOJiamin.

*Department of Neurology, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong Sichuan 637000, China

WANGXiaoming,Email:shakins@163.com

ObjectiveTodiscussthegeneticassociationofinterleukin(IL)-17polymorphismswithmultiplesclerosis(MS)inSichuanHanpopulation.MethodsTwosinglenucleotidepolymorphisms(SNPs),rs763780ofIL-17Fgeneandrs2275913ofIL-17Ageneweregenotypedin126MSpatientsand176healthycontrolsbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphismmethod(PCR-RFLP).Allcontrolsubjectsandpatientswereethnicallyandgeographicallymatched.AlleleandgenotypefrequenciesdistributionsbetweenpatientsandcontrolswerecomparedusingtheChi-Squaretest.ResultsAsignificantlyincreasedrs763780TTgenotypefrequency(correctedP=0.036)andTallelefrequency(correctedP=0.048)werefoundinMSpatientsincomparisonwithcontrols.Thegenotypicandallelicfrequenciesofrs2275913inIL-17AgenewerenotdifferentbetweenpatientswithMSandcontrols.ConclusionsTheseresultssuggestthatrs763780isassociatedwithmultiplesclerosisinaSichuanHanpopulation,TTgenotypeandTalleleofrs763780mayconferhigherriskofMS,whereasrs2275913inIL-17AgeneisnotassociatedwithMS.

multiplesclerosis;interleukin-17;polymorphism,singlenucleotide

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.004

南充市应用技术研究与开发资金资助项目(南充科技局13A0031)

637000 川北医学院(付红梅、罗家明)；637000 川北医学院附属医院神经内科(王寅旭、王晓明)

王晓明，Email：shakins@163.com

R744.5+1

A

1006-2963 (2015)01-0012-04

2014-04-19)