杨文化，周 瑞，李科友

（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100）

银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病，以表皮细胞过度增生和分化异常为主要发病特征。全球大约2%的人患有银屑病，其中约25%是中、重度型病症［1－2］。研究结果表明环境、免疫和遗传为其发病的主要因素［3］。而该病的确切发病机制极为复杂，目前还未完全确定。因此，寻找新的治疗银屑病药物具有重大意义。近几十年来，植物提取物因为在多种银屑病角质细胞中具有抗增殖、促凋亡等作用，而逐渐作为银屑病治疗的替代药物来研究［4］。

杏（P.armeniaca L.var.ansu Maxim.）是在欧亚大陆和美洲广泛种植的经济树木。杏仁的口味可分为甜杏仁、微苦杏仁和苦杏仁三类［5］。药理学研究表明，苦杏仁拥有抗氧化、抗癌、抗微生物和抗炎活性［6－7］。苦杏仁能治疗哮喘、支气管炎、肺气肿、便秘、白癜风及疼痛。此外，它也可以治疗皮肤病，如疖、痤疮。有关提取于杏仁种子的杏仁精油的抗菌活性有人进行了报道［8］。但是关于BAEO 抗银屑病的研究报道较少，本试验以银屑病模式细胞HaCaT 作为体外试验模型，研究BAEO 对人表皮细胞的增殖以及凋亡的影响，以探讨其抗银屑病的可能机理。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜的苦杏仁种子于2012年6月购买于甘肃省镇原县，并经过西北农林科技大学林学院魏安智教授鉴定；一个标本（条码0150525）储存在西北农林科技大学生命科学学院植物标本室；DMEM 培养液和胎牛血清均为Gibco公司产品；胰蛋白酶求购于Sigma公司；4g／L 台盼蓝染液和SRB 试剂均购自英国Sigma aldrich 公司；100×青霉素及链霉素溶液为碧云天生物公司产品；细胞周期检测试剂盒和Annexin V－FITC／PI双染细胞凋亡检测试剂盒均求购于为凯基生物；Caspase－3、PARP、β－Actin抗体为碧云天生物公司产品；羊抗鼠／抗兔二抗购自于CWBIO 公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 BAEO 提取 用于本试验的BAEO 采用水蒸汽蒸馏法进行提取。将苦杏仁种子粉碎，过40目筛，准确称取200g，常温下浸泡在500 mL 的圆底烧瓶中水解4h。然后，用克莱文杰装置进行水蒸气蒸馏。收集蒸馏所得的精油，经过乙醚萃取并加入无水硫酸钠干燥脱水，过滤后即得到BAEO。BAEO 使用时用吐温80作为增溶剂，用DMEM 培养基将其稀释到所需的浓度。

1.2.2 气相色谱－质谱联用分析 色谱条件：采用日本Shimadzu公司GCMS－QP2010气相色谱－质谱仪，色谱柱为rxi－5ms毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；采用程序升温，50 ℃保持2min，再以10℃／min增加到280 ℃并保持5min；载气是氦气，流速为3mL／min；分流比为10∶1。

质谱条件：电离方式为EI，轰击电压为70eV，接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，质量扫描范围40m／z～550 m／z。BAEO 未知成分是通过与色谱仪所配置NIST08谱库相匹配，并结合保留指数及相关文献资料所获得。

1.2.3 细胞培养 人永生化角质形成细胞HaCaT购买于中国科学院昆明动物研究所。细胞培养液含有100mL／L灭活的胎牛血清和100U／mL 青霉素和链霉素。细胞置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2d～3d换新鲜培养液。到细胞铺满培养瓶底约80%时进行细胞试验。

1.2.4 SRB细胞增殖试验 BAEO 和及其主要成分苯甲醛对HaCaT 细胞的细胞毒性采用SRB法测量。细胞接种于96孔板培养，浓度为5×103细胞／孔，每孔体积200μL。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的BAEO 或苯甲醛，每个浓度设4 个复孔，分别于24、48、72h后进行细胞毒性检测。细胞用100 μL预冷的500g／L三氯乙酸（TCA）固定，在4 ℃冰箱放1h后，用去离子水洗涤3次，自然晾干。在室温下经100μL 4g／L 的SRB 染液染色30 min，用10mL／L乙酸洗涤3次，自然晾干，最后用100μL的Tris－HCl缓冲液（pH 10.4）溶解。用酶标仪于570nm 处测吸光度值（OD）。细胞生长抑制率（%）＝［（对照组平均OD 值－用药组平均OD 值）／对照组平均OD 值］×100%。采用GraphPad Prism 5确定细胞半数抑制浓度（IC50）。

1.2.5 细胞周期检测 采用PI单染法检测BAEO作用于HaCaT 细胞后细胞周期的变化。将细胞以5×105细胞／mL 的密度接种于6孔板，每孔2mL。次日，待细胞贴壁后，不同浓度的BAEO（0.1、0.25、0.5mL／L）处理HaCaT 细胞24h，然后收集细胞，用预冷的PBS洗涤，并用预冷的700mL／L 乙醇固定和放存在4 ℃过夜。上机前用预冷的PBS 洗2次，加100μL RNase A 37 ℃水浴30min，再用400 μL的PI 4 ℃避光染色30min。尽快对染色细胞进行流式细胞仪分析。试验重复3次，取均值。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 用Annexin VFITC和PI双染色分析细胞凋亡。将细胞以5×105细胞／mL的密度接种在6孔板，每孔2mL。用浓度分别为0.1、0.25和0.5mL／L的BAEO 处理细胞，24h后收集细胞，PBS洗涤，并重悬在500μL 的缓冲液中，先 后 加 入 各5μL 的Annexin－V－FITC 和PI，常温下避光染色30min。流式细胞仪检测细胞凋亡。试验重复3次，取均值。

1.2.7 Western blot分析 将细胞以5×105细胞／mL的密度接种在6孔板，每孔2mL。不同浓度的BAEO处理HaCaT细胞24h后，洗涤细胞两次，用含有0.5mmol／L苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制剂（PI）的细胞裂解液在冰上裂解细胞，BCA 法蛋白定量。样品蛋白用SDS－PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜（NC）上。50g／L 脱脂奶粉封闭1h，孵育一抗4℃过夜，洗膜，二抗室温孵育2h，洗膜。用ECL显色试剂和Chemidoc XRS＋成像系统曝光和显影。

2 结果

2.1 BAEO 的化学成分分析

用水蒸气蒸馏法得到的BAEO 经气相色谱－质谱联用仪检测出15 种成分，占总成分的97.81%。其中7种为芳香类物质，并占总精油的82.54%（表1）。主要成分分别为苯甲醛（57.36mL／L）、苯甲酸（12.73mL／L）、扁桃腈（9.54mL／L）。这个结果与Lee H H 等［8］报道的杏仁精油成分相似。

2.2 BAEO 对HaCaT 细胞增殖的影响

不同浓度BAEO 和苯甲醛经过不同时间对HaCaT 细胞抑制作用具有相似的影响。BAEO 和苯甲醛作用 于HaCaT 细胞24 h 后，在0.05%mL／L～1mL／L范围内均有显著地抑制作用（P＜0.01），且随着浓度和时间增加，抑制效果越明显，均呈剂量和时间依耐性。然而，BAEO（48h，IC50＝142.45μg／mL）对细胞的毒性远大于苯甲醛（48h，IC50＝394.17μg／mL）的细胞毒性（表2）。

2.3 BAEO 对HaCaT 细胞周期的影响

不同浓 度BAEO 处 理 细 胞24h 后，G0／G1 期细胞所占比例从对照组的30.03%±2.29%随着药物浓度的增加分别升到32.21%±0.10%、38.77%±1.49%和44.62%±3.50%，而S 期的细胞所占比例从对照组的51.12%±2.12%分别降到46.27%±1.46%、38.10%±6.60%和37.96%±2.12%，G2／M 期 变 化 不 明 显，提 示BAEO 使 HaCaT 细胞周期阻滞在G0／G1期（图1）。

表1 BAEO 化学成分GC－MS分析Table 1 Chemical composition analysis of BAEO by GC－MS

表2 苯甲醛和BAEO 对HaCaT 细胞增殖的抑制作用（n＝4，x±SD，%）Table 2 Proliferation inhibitory effect of benzaldehyde and BAEO on HaCaT cells（n＝4，x±SD，%）

2.4 BAEO 对HaCaT 细胞凋亡的影响

Annexin V－FITC／PI 双 染 法 流 式 细 胞 仪（FCM）检测见图2，左下限Annexin V（＋）／PI（＋）表示活细胞群，左上限Annexin V（－）／PI（＋）表示自噬坏死细胞群，右下限Annexin V（＋）／PI（－）表示早期凋亡细胞群，右上限AnnexinV（－）／PI（－）表示 晚 期 凋 亡 细 胞。0.1、0.25、0.5 mL／L 的BAEO 处理24h后，细胞凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）从空白对照组2.63%分别上升到6.07、20.08、26.32%。在0.25 mL／L～0.5 mL／L 范围内，活细胞率相对于空白对照组有统计学意义（P＜0.05）。早期凋亡率随BAEO 浓度的增加而增多，晚期凋亡在浓度为0.25mL／L时达到峰值。

2.5 BAEO 对HaCaT 细胞Caspase－3和PARP蛋白的影响

为了进一步研究细胞凋亡的机制，利用Western blot 分 析 了Caspase 凋 亡 相 关 蛋 白（图3）。BAEO 作用24h后，Caspase－3和PARP 蛋 白 表 达量下调，且均出现了切割条带，表明细胞发生了凋亡。

3 讨论

银屑病是常见慢性皮肤病，临床发病率呈不断上升趋势［9］。其主要病理特征是角质形成细胞的增殖异常活跃，皮损细胞不能及时凋亡。抑制角质形成细胞增殖、促进其凋亡已成为抗银屑病的重要途径之一。近年来，众多的天然植物成分因诱导人角质细胞HaCaT 凋亡而应用于银屑病治疗。如提取于茜草的1，4－二羟基－2－萘酸［10］。在大量的天然提取物中，精油因具有多种生物活性，而被应用于杀虫、杀菌、抗肿瘤等［11］。本研究采用提取于苦杏仁种子的BAEO 处理人永生化角质形成细胞系HaCaT，观察到BAEO 对HaCaT 细胞有显著的增殖抑制和凋亡诱导作用。

图1 流式细胞术检测BAEO 对HaCaT 细胞周期的影响Fig.1 Effect of BAEO on the cell cycle of HaCaT cells detected by flow cytometry

图2 流式细胞术检测BAEO 对HaCaT 细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of BAEO on the cell apoptosis of HaCaT cells detected by flow cytometry

BAEO 主 要 成 分 是57.36 mL／L 的 苯 甲 醛、12.73mL／L 的苯甲酸、9.54 mL／L 的扁桃腈。高含量苯甲醛可能是由于在样品研磨过程中苦杏仁苷和β－葡萄糖苷酶相互接触生成的，扁桃腈是由苦杏仁苷分解成苯甲醛和氰化氢的过程中产生的中间产物［12］，苯甲酸是由于苯甲醛的氧化。

通过SRB法检测不同浓度的BAEO 对HaCaT细胞生长抑制作用，试验结果显示，BAEO 处理细胞24、48和72h后，IC50值分别为324.97、142.45、65.52μg／mL，表明BAEO 对HaCaT 细胞在体外有比较显著的增殖抑制作用。且BAEO 抑制HaCaT 细胞增殖呈明显的剂量和时间依赖性，以及细胞毒性比苯甲醛高。Adams T 等［13］的研究也表明苯甲醛只有在高剂量时对人和动物细胞有细胞毒活性。通过流式细胞术检测HaCaT 细胞，结果表明BAEO 作用HaCaT 细胞24h后，可使细胞周期的分布发生明显变化，使停滞于G0／G1期的细胞比例明显增多，细胞凋亡率与空白对照组相比明显增加，且随浓度增大而增大，具有明显的浓度依赖性。

细胞凋亡是体内细胞主动发生，受一系列基因控制的自发性死亡方式，是维持细胞内环境稳定的重要调节机制之一。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白（Caspase）是细胞凋亡过程中的一个重要调节酶，负责细胞的凋亡诱导作用，通常以无活性的酶原形式存在［14］。根据其结构和功能的不同，可分为两类：起始因子如Caspase－4、5、8 和10 负责对效应前体的切割；效 应 因 子 如Caspase－3、6 和7 负 责 切 割 调节蛋白和结构蛋白［15］。凋亡信号刺激细胞后，作为Caspases中非常关键的凋亡执行者Caspase－3，切割其下游靶蛋白（如PARP）［15］。本试验检测到了Caspase－3和PARP 的剪切，表明BAEO 可以促进细胞凋亡。

综上所述，本试验从体外水平证明了BAEO 能够有效抑制HaCaT 细胞增殖。同时3种不同的凋亡形式，细胞周期阻滞、细胞凋亡率增加和Caspase－3活化及PARP剪切，表明了BAEO 也能有效地诱导细胞凋亡。本试验仅探索了BAEO 体外对HaCaT 细胞的影响，因此，BAEO 生物活性成分对增殖和凋亡的影响以及体内试验尚需进一步研究。

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