刘玉辉，赖金伦，寇明明，邓明亮，刘瑞宁，陈颖钰，2，胡长敏，2＊，郭爱珍，2＊

（1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070）

乳腺炎是严重危害人类及动物健康的常见疾病。奶牛乳腺炎被列为“奶牛三大疾病”之首，造成了奶牛业严重的经济损失，全世界约有2.2亿头奶牛，其中约有三分之一的奶牛患有各种类型乳腺炎［1－2］。

建立小鼠原代乳腺上皮细胞（mouse mammary epithelial cells，MMECs）和奶牛原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）体外分离培养体系是开展乳腺炎致病机制研究工作的基础。Wang W 等［3］建立MMECs培养体系，研究中药厚朴酚调控脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导MMECs炎症反应的机制。Olga W 等［4］也建立了BMECs培养体系研究病原菌与BMECs的相互作用。通过建立MMECs和BMECs体外培养体系模拟体内试验过程，既增加了试验的便利性，也减少了试验成本；同时可为乳腺生长发育、泌乳机制及乳腺生物反应器的研究提供参考。

1957年Lasfargues等首次实现了MMECs的直接培养，成功建立了BMECs 细胞系BMGE＋HM、BMGE＋H 及EMGE－H［5］。张以涛等［6－7］分别研究了MMECs和BMECs体外培养特性，但有关MMECs及BMECs的分离培养、生长特性的比较研究尚未见报道。在本研究中，采用改良混合酶消化结合差速贴壁法分别从小鼠和奶牛乳腺中提取出高纯度的MMECs及BMECs，进行两种细胞的体外培养传代和冻存复苏试验，对比了MMECs和BMECs的分离、培养方法、生长特性、细胞传代和复苏性状，为选择及建立合适的MMECs和BMECs体外模型，以及开展乳腺相关功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 妊娠后期SPF 昆明鼠购自湖北省疾病控制中心，泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺组织采自湖北省某兽医站。

1.1.2 主要试剂及耗材 胶原酶（Collagenase）Ⅰ和Ⅱ为Solarbio公司产品；2.5g／L 胰蛋白酶－0.2 g／L乙二胺四乙酸（Trypsin－EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）为Gibico产品；胰岛素（Insulin）、转铁蛋白（Transferrin）、二甲基亚砜（DMSO）、两性霉素B 和庆大霉素为Sigma公司产品；DMEM／F12、青链霉素双抗（Penicilin－Streptomycin Solution）为Hyclone公司产品；表皮生长因子（EGF）为SinoBiological公司产品；兔源的角蛋白18多克隆抗体（Rabbit Anti－Cytokeratin18）为Bioss公司生产；FITC 标记的羊抗兔二抗为Southern Biotech公司 产 品；T25、T75 细 胞 培 养 瓶12 孔、24孔细胞培养板为Lab Serv公司产品。

1.1.3 细胞消化液、培养液及冻存液 提取细胞时所用的消化液为2.5g／L Trypsin－0.2g／L EDTA与胶原酶Ⅰ、Ⅱ型等比例混合液，Ⅰ、Ⅱ型胶原酶均配制为2mg／mL 的工作液（100 mg胶原酶添加5 mL胎牛血清和45mL DMEM／F12）。细 胞生长培养液：基础培养液为DMEM／F12 添加100 mL／L FBS 10 mL／L Penicilin－Streptomycin Solution，5 ng／mL EGF，5μg／mL Insulin，5μg／mL Transferrin；冻存培养液：900 mL／L FBS＋100 mL／L DMSO。

1.2 方法

1.2.1 MMECs的分离与纯化 取健康妊娠后期SPF昆明鼠，断颈处死后在750 mL／L 酒精中浸泡60s，无菌采集小鼠倒数第2对乳腺，避开血管且去除淋巴结后称重；将采集到的乳腺组织放入含20 mL／L双抗的PBS中，清洗干净后置小烧杯中剪碎至糊状，随后转入锥形瓶中密封，37℃、110r／min恒温振荡培养消化约2h～3h至无成块组织（每克组织加入4mL Trypsin－EDTA 及4mL 胶原酶Ⅰ、Ⅱ等比例混合液，消化时间根据消化组织量而异）；将消化后的匀浆液转入15 mL 无菌离心管中25℃、250r／min离心5min。收集离心后的沉淀，加入适量含100mL／L FBS的DMEM／F12，用200目细胞筛过滤去除未消化组织块。收集滤液，经相同条件离心后弃上清，加入适当2.5g／L Trypsin－0.2g／L EDTA 混合液重悬，作用2 min使细胞分散为单个细胞，随后加入5mL含100mL／L FBS的DMEM／F12终止反应。反复离心3次清洗沉淀后加入适当培养液重悬，用400目细胞筛过滤后离心。沉淀中加入适量细胞生长液重悬后接种到细胞培养皿中差速贴壁1h，去除成纤维细胞，此操作重复2次，最后将细胞计数后接种于细胞培养瓶中进行培养。

1.2.2 BMECs的分离与纯化 健康泌乳中期荷斯坦奶牛屠宰时，乳腺皮肤经酒精消毒后用无菌手术刀切开，避开血管、脂肪及淋巴组织，剪取约5g腺泡处乳腺组织放入含2.5μg／mL两性霉素B及50 μg／mL庆大霉素的PBS中，置冰盒中带回实验室，提取步骤与1.2.1 MMECs相同，但奶牛乳腺组织振荡消化时间约4h～4.5h。

1.2.3 MMECs及BMECs的免疫荧光鉴定 将分离的MMECs接种于加有爬片的12孔板中培养至单层，以小鼠乳腺成纤维细胞作阴性对照；吸弃细胞生长液，PBS清洗3次后用40mL／L 多聚甲醛固定30min；同上清洗后取50 mL／L BSA 溶液封闭30 min；封闭完成后吸干封闭液，并将细胞充分浸泡于兔源角蛋白18多克隆抗体（稀释倍数为1∶200）中，4℃孵育过夜；PBS清洗细胞后加入FITC 标记的羊抗兔二抗（稀释倍数为1∶100），室温避光孵育1h；PBS清洗除去二抗，Hoechst 33342 室温避光染色10min；抗荧光猝灭剂封片后在激光共聚焦显微镜下拍照。

BMECs的固定、染色步骤及免疫荧光鉴定方法与MMECs的鉴定方法相同，同时设定奶牛乳腺成纤维细胞作阴性对照。

1.2.4 MMECs及BMECs的传代 MMECs及BMECs生长汇合至单层时，用适量2.5g／L Trypsin－EDTA，37℃消化10min～15min，以1∶2的比例进行细胞传代，补加生长培养液继续培养。

1.2.5 细胞生长曲线的绘制 将分离纯化的MMECs和BMECs以1×104个／mL的密度接种于24孔板中，然后放入二氧化碳培养箱中培养，每2d换液1次，采用细胞计数仪连续8d进行细胞计数。以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘图，细胞数取3个孔的平均值。

1.2.6 MMECs 及BMECs 的 冻 存 与 复 苏MMECs及BMECs 冻存前同细胞传代方法，见

1.2.4 。取消化后细胞，25℃、1 000r／min 离心5 min，收集细胞；用1.1.3所示细胞冻存液将细胞分装至1.5mL冻存管中，每管1mL，液氮中保存。解冻时，从液氮中取出MMECs及BMECs冻存管，37℃水浴快速解冻细胞，而后加入细胞生长培养液，25℃、1 000r／min离心5min，收集细胞并接种到培养瓶中培养。

2 结果

2.1 MMECs与BMECs分离、纯化结果

分别应用改良的混合酶消化结合差速贴壁法成功提取了高纯度的MMECs和BMECs。尽管两种细胞培养体系的建立步骤类似，但在取材部位、清洗液的选择、清洗次数及消化时间等方面仍存在明显差异（表1）。

2.2 原代MMECs与BMECs培养特性

2.2.1 原代MMECs培养特性 根据MMECs与小鼠乳腺成纤维细胞贴壁速度的差异，经两次差速贴壁法将MMECs与小鼠乳腺成纤维细胞分离。分离后的细胞培养3d左右，分别得到单一的MMECs与小鼠乳腺成纤维细胞。倒置显微镜下观察，MMECs呈现典型的铺路石样外观，且细胞连接紧密，间隙清晰（图1a）；当MMECs长满后继续培养会出现典型的穹顶状结构，穹顶内仍有一层MMECs（图1b）。分离出的小鼠乳腺成纤维细胞呈典型的梭形（图1c）。

表1 MMECs与BMECs分离方法比较Table 1 Comparison of separation methods between MMECs and BMECs

图1 MMECs及小鼠乳腺成纤维细胞培养形态观察（10×）Fig.1 Morphology of MMECs and mouse mammary fibroblasts（10×）

2.2.2 原代BMECs培养特性 通过改良混合酶消化结合差速贴壁法，分别获得BMECs和奶牛成纤维细胞。倒置显微镜下观察，BMECs轮廓清晰，排列紧密，呈现典型的鹅卵石样外观。对BMECs进行细胞形态跟踪观察评价，原代BMECs呈岛屿状生长，由中间向四周扩散，细胞生长6d汇合成单层（图2A）。奶牛乳腺成纤维细胞排列紧密，细胞形态为梭形（图2B）。

2.3 传代MMECs与BMECs培养特性

2.3.1 MMECs传代观察 将MMECs以1∶2的比例进行传代，传代细胞并未像原代MMECs出现铺路石样外观，细胞间隙变大，排列不规则且不能汇合成单层（图3）。

2.3.2 BMECs传代观察 将BMECs以1∶2进行传代，传代后2d细胞即汇合成单层，且传代细胞与原代BMECs形态一致，细胞生长状态良好（图4a、图4b）。当BMECs传至第9代时，细胞出现了空泡与老化现象（图4c、图4d），死细胞增多。

2.3.3 细胞生长曲线 以1×104个／mL 的细胞数将纯化后的MMECs和BMECs（第2代）接种于24孔板中，通过细胞计数得出的生长曲线见图5。MMECs在接种到24 孔板中后，细胞出现生长缓慢，不能汇合成单层细胞状态，刚开始贴壁的细胞在随后的生长过程中逐渐死亡，这与上述MMECs不能传代相符；BMECs的生长曲线显示：0～3d为细胞生长的滞留期，细胞处在适应环境的过程，从第4天开始细胞进入对数生长期，直至第7天，之后细胞生长步入平台期。

2.4 MMECs与BMECs的冻存与复苏

使用相同的冻存液冻存MMECs和BMECs，复苏后的细胞均能汇合为单层，且生长状态良好。但MMECs只能冻存原代细胞，而BMECs可对传代细胞进行冻存（图6）。

2.5 MMECs与BMECs免疫荧光鉴定

MMECs与BMECs经兔源角蛋白18多克隆抗体孵育后加入FITC 标记的荧光二抗，同时用Hoechst33342标记细胞核，置激光显微镜下观察。角蛋白18特异性存在于MMECs与BMECs的胞质中，经免疫荧光染色后胞质呈现绿色，细胞核呈蓝色（图7a、图7c）。小鼠及奶牛乳腺成纤维细胞缺乏角蛋白18，仅细胞核呈现蓝色荧光（图7b、图7d）。

3 讨论

3.1 MMECs和BMECs的分离鉴定

图2 BMECs及奶牛乳腺成纤维细胞培养形态观察（10×）Fig.2 Morphology of BMECs and bovine mammary fibroblasts（10×）

图3 传代后的MMECs形态观察（10×）Fig.3 Morphology of passaged MMECs（10×）

在原代乳腺上皮细胞提取方法上，人们大多采用先胰酶粗消化后再用胶原酶消化的方法［8－9］，由于乳腺组织中含有多种细胞，酶消化法提取出来的细胞多为乳腺上皮细胞和成纤维细胞的混合物，因此仍需对提取所得细胞混合物进一步纯化。多项研究表明，成纤维细胞较乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性高，在贴壁培养时不仅贴壁时间短，且贴壁后更易被胰酶消化。因此可根据成纤维细胞和乳腺上皮细胞特性的差异，采用差时消化和差速贴壁的方法对乳腺上皮细胞进行纯化［10］。大多数人在纯化方法上选择根据两种细胞对胰酶的敏感性差异开展纯化［11］，由于该方法是在培养细胞的过程中进行的，直接获得的乳腺上皮细胞纯度不高，且胰酶消化时间的不确定性也增加了纯化的难度。

图4 传代BMECs形态观察Fig.4 Morphology of passaged BMECs

图5 小鼠和奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线Fig.5 Growth culture of MMECs and BMECs

图6 经冻存复苏后的细胞形态（10×）Fig.6 Cell morphology after cryopreservation and resuscitation

图7 角蛋白18免疫荧光鉴定MMECs与BMECsFig.7 Cytokeratin18expression in MMECs and BMECs by immunofluorescence staining analysis

本研究中，初始我们采用胰酶与胶原酶分段消化的方法分离MMECs，得到细胞成纤维细胞与乳腺上皮细胞的混合物，然后根据其对胰酶敏感性不同进行纯化，考虑到纯化时胰酶量差异、消化时间的不确定性，以及胰酶反复作用造成乳腺上皮细胞损伤，随后我们对乳腺上皮细胞的提取方法做了一些改良，一是在酶消化时采用胰酶与胶原酶Ⅰ、Ⅱ等量混合的方法进行消化，直至将乳腺组织消化成无明显可见大颗粒为止。改进后的消化方法不仅减少了试验步骤，增加了试验的便捷性，而且混合酶同时消化乳腺组织，可以使乳腺组织消化更彻底充分，更容易获得目的细胞。二是直接采用差速贴壁法，将混合酶消化后的两种细胞混合物直接培养，根据成纤维细胞先贴壁的特性将其去除，从而得到高纯度的乳腺上皮细胞。

角蛋白是乳腺上皮细胞重要的标志性蛋白，乳腺上皮细胞中的细胞骨架蛋白主要以角蛋白－7、8和18为主，而成纤维细胞中缺少角蛋白－18［12］。本研究通过角蛋白18 免疫荧光染色成功鉴定MMECs和BMECs。

3.2 MMECs和BMECs生长特性

MMECs和BMECs的形态存在差异，MMECs偏大，细胞趋向于多角形，细胞间排列紧密，细胞间隙小，呈铺路石样外观；BMECs体积稍小，呈现鹅卵石样外观（图1、图2）。另外，BMECs培养初期细胞量少，后期细胞增殖快（图2），可见BMECs分裂增殖能力较MMECs强。

3.3 MMECs和BMECs的传代特性

在本研究中，MMECs传代后老化，且不能长满（图3），这与易琼等描述的MMECs 可以传代不符［13］，分析原因可能是乳腺上皮细胞的生长特性为形成乳腺细胞团并以团块扩张的形式生长［14］，MMECs传代减少了细胞量，以1∶2传代的细胞密度仍然较低，导致细胞团块不能形成；另外，推测MMECs传代过程中缺失了上皮细胞的某些成分或是生长培养基不能满足传代细胞的营养供应，从而影响其分化增殖［15］。奶牛BMECs可以传至第9代，但后续传代时细胞出现明显的易老化特征，细胞间形成空泡，细胞不能汇合成单层（图4c、4d），这符合原代细胞的生长特性。

同时纯化后的MMECs和BMECs的生长曲线更进一步说明了MMECs在细胞密度低的情况下不能生长，分裂增殖能力差；而BMECs的分裂增殖能力较强，细胞的生长曲线呈现典型的S型，这与李文清等［16］描述相符。

3.4 MMECs和BMECs的冻存与复苏

本研究中，根据文献报到的冻存液（900 mL／L FBS＋100mL／L DMSO）进行MMECs和BMECs的冻存［17］，复苏冻存后的细胞生长良好。张以涛等以DMEM／F12∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1的冻存液成功冻存了MMECs，Danowski K 等［18］也以同样比例的冻存液有效冻存了BMECs。由于MMECs不能传代，因此直接对原代MMECs进行冻存，所需细胞量大。而BMECs可用传代细胞进行冻存。

4 小结

本研究成功建立原代MMECs与BMECs细胞培养体系，同时比较了MMECs与BMECs的分离方法、体外生长培养、传代及冻存与复苏特性，但对于MMECs不能传代的原因仍需作进一步研究。开展培养原代乳腺上皮细胞及建立乳腺上皮细胞培养体系的研究，不仅有助于建立乳腺生物反应器及体外乳腺疾病研究模型，同时也为体外研究乳腺功能奠定了理论基础。

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