陈福辉 ，程慧健 ，杨梦 ，潘欢弘 ，熊长辉 ，郑翰

(1、江西省疾病预防控制中心，江西 南昌330029；2、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 昌平102206)

猪链球菌属于链球菌属R群，是一种人畜共患病病原体。自1968年丹麦首次报道人感染猪链球菌以来，曾在中国香港、荷兰、德国、加拿大、瑞典、法国等地也出现过猪链球菌感染人的病例，该病发病呈世界性分布[1]。据有关报道[2]：我国1998年和2005年分别在江苏四川发生了大规模的血清2型猪链球菌感染人暴发，病死率分别高达56%和19%。还有研究发现一些非疫区猪链球菌的检出率很高[3-6]。表观健康猪群携带猪链球菌的现状对猪的养殖、屠宰、加工、销售等环节的从业人员构成了潜在的威胁，为了解和掌握江西省表观健康猪群携带猪链球菌的状况，为探索猪链球菌病更有效的预防和控制策略及方法，2011年至2012年，在曾经发生过猪链球菌感染人的景德镇市和崇仁县开展了猪携带猪链球菌的状况调查。现将调查结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 调查地点及对象 选择发生过猪链球菌感染人的景德镇市和崇仁县的一些屠宰场的表观健康猪群以及周围散养户的表观健康猪群。

1.2 调查内容 使用自制的无菌钢丝棉拭子伸入猪咽喉部进行涂抹采集屠宰场的来源信息清楚的表观健康猪群和散养户的表观健康猪群的鼻咽拭子，同时立即采集屠宰后生猪的扁桃体，进行猪链球菌病原分离鉴定。

1.3 主要试剂与仪器 DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)，2×Taq MasterMix购自康为世纪公司，Wizard Genomic DNA Purification Kit购自美国Promega公司，Lysozyme购自北京博奥拓科技有限公司，THB培养基购自美国BD公司，PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，呋喃妥因购自生工生物工程(上海)有限公司，多粘菌素B购自北京陆桥技术有限责任公司，氨曲南购自南京都莱生物技术有限公司，胎牛血清(FBS)购自美国Invitrogen生命技术公司，PCR仪(SensoQuest Labcycler)购自德国Senso公司，凝胶成像系统(GEL Doc2000)购自美国Bio-Rad公司。

1.4 检测方法 猪链球菌液体选择性培养基为以THB固体粉末配置的浓度为30mg/ml的液体培养基，高压灭菌后平衡至室温，按指定浓度加入下列成分：呋喃妥因 15μg/ml，氨曲南 50μg/ml，多粘菌素 B 10μg/ml，胎牛血清(FBS)37.5μl/ml。 将采集后的猪鼻咽拭子放入上述肉汤中，置37℃，5%CO2增菌18h，挑适量增菌液划线接种于StS平板[7]，培养24h后挑选可疑菌落接种于血平板，分纯培养18h后，挑取单个菌落进行猪链球菌种基因(16s rRNA)及三种毒力基因PCR鉴定[8](表1)，猪链球菌种基因(16s rRNA)的反应条件为94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，25 个循环， 最后延伸 72℃5min；猪链球菌溶菌酶释放相关蛋白编码基因(mrp)的反应条件为 94℃预变性 5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环， 最后延伸 72℃5min；溶血素基因(sly)的反应条件94℃预变性5min，94℃30s，51℃60s，72℃90s，30 个循环， 最后延伸 72℃5min；细胞外蛋白因子编码基因 (ef)的反应条件94℃预变性 5min，94℃30s，56℃30s，72℃30s，30 个循环，最后延伸72℃5min。最后挑猪链球菌种基因(16s rRNA)阳性菌株做血清玻片凝集试验，即取一滴诊断血清于玻片上，用接种环挑取单个菌落与玻片上的诊断血清充分混合，静止1min，观察凝集反应情况，同时用生理盐水作阴性对照。

2 结果

本次调查中，共采集到301份表观健康猪的鼻拭子和扁桃体样本，通过猪链球菌病原分离后，经猪链球菌种基因(16s rRNA)PCR鉴定，检出2株猪链球菌(见图1)，经血清分型为猪链球菌2型，经PCR检测，其毒力基因mrp、sly、ef均为阴性。经统计，本次调查中表观健康猪群携带猪链球菌的带菌率为0.66%。

3 讨论

注：图中泳道 1：marker；2-9：菌株；10：阴性对照；11：阳性对照

人感染猪链球菌病多数是由于人直接接触携带猪链球菌或病死的猪而引发感染的，而重症病例多数则是由于感染了血清2型猪链球菌所致，其临床表现主要为菌血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎、肌炎等，并且预后较差。近十余年来，欧美一些国家及我国的江苏、四川等地区相继报道过生猪屠宰人员、生肉加工人员发生感染血清2型猪链球菌的重症病例。江西省2005年、2006年均在景德镇市、崇仁县接触病死猪的人群中也出现过人感染猪链球菌的病例，但经流行病学调查发现他们接触的病死猪均来自外地[9]。而随后几年，江西省境内再未出现人感染猪链球菌的病例，是我省猪携带猪链球菌水平下降还是猪链球菌携带的毒力基因水平降低或其他原因所致，尚不清楚，其原因有待进一步研究探讨。目前检测猪链球菌的传统细菌培养、生化鉴定检测方法的检测时间较长，大约需要2～3d，不利于急性发病患者的及时诊疗，而近年来，随着分子生物学检测方法的引入应用，大大缩短了检测时间，但此方法得不到药敏试验、毒力检测、分子溯源等所需要的菌株，因此，应同时进行传统的细菌培养与分子生物学检测。

从本次调查结果来看，调查地点的表观健康猪群携带猪链球菌的带菌率仅为0.66%，而据江苏省兽医研究所报告，正常猪群中血清2型猪链球菌的带菌率平均为42.6%[10]。新西兰和澳大利亚的研究表明健康生猪携带猪链球菌的带菌率为75%[11]。2009年中国人兽共患病学学报报道，从我国20个不同地区屠宰场采集248份猪扁桃体样本中，检测出14株猪链球菌，带菌率为5.65%[12]。贵州省2006-2011年间6年的宿主动物监测数据显示[13]：3969份表观健康猪群鼻拭子和扁桃体样本中未检出猪链球菌。综合上述报道数据比较分析，本次调查中我省两个调查地点的表观健康猪群携带猪链球菌的带菌率较低，其原因可能与采集的样本数量较少(301份)以及调查的地点选取数量较少仅为2个有关，这有待今后研究中进一步扩大调查范围，增加样本采集数量。有关文献显示[14]:我国不同地区的337份健康猪咽拭子标本，进行16SrRNA、gapdh基因PCR检测，其检出率无统计学差异，且其病原分离率亦无统计学差异。而我省本次调查中表观健康猪群携带猪链球菌的带菌率仅为0.66%，是否存在地区差异，这也有待进一步研究。

猪链球菌感染是动物二类传染病，目前还没有证据证明可以人传人，人感染猪链球菌病是直接接触感染[15]。我省2005-2006年间发生的人感染猪链球菌病例均由于接触病死猪而引起感染，因此，应该继续加强对表观健康猪携带猪链球菌的监测，同时重点突出对表观不健康猪和病死猪的监测与管理，以及加强生猪养殖、屠宰、贩卖、销售、加工等各环节相关从业人员的个人防护和健康教育，这些措施将对猪链球菌病有效防控起着重要作用。

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