雷林洁　杨淼　霍潘峰　王军　马亮英

【摘 要】 目的：建立小儿腹泻散中没食子酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱：Inert Sustain C18柱（250×4.6mm，5μm）；检测波长：271nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：40℃；流动相：甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）。结果：没食子酸在1.55～62μg·ml-1范围内呈良好的线性关系，r=0.9999，平均回收率为99.24%，RSD=0.64%。小儿腹泻散中没食子酸的含量为5.18mg·g-1，RSD=1.66%。结论：该方法操作简单、准确，可用于小儿腹泻散中没食子酸的含量测定及质量控制。

【关键词】 HPLC；小儿腹泻散；没食子酸；含量测定

【中图分类号】R917 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）13-0004-02

小儿腹泻散为我院的医院制剂（制剂批准文号：新药制字Z20040551），全方由儿茶、五倍子、清半夏、朱砂、枯矾、氢氯噻嗪等药组成，已临床使用多年，具有涩肠止泻的功效，主要用于小儿“水样便”腹泻。处方中除儿茶具有收敛止泻的作用外，五倍子中的鞣质也是其止泻的主要化学成分。多年来，鞣质成分在医药领域被公认为具有较强的收敛性及蛋白质凝固作用，临床上用于各种止血、止泻及抗菌抗病毒[2]。随着新技术、新方法的应用，还发现鞣质具有抗脂质过氧化、抗突变、清除自由基、抗艾滋病与抗肿瘤等多种药理活性[3]，使其在临床中日益受到重视，也对没食子酸的含量测定方法提出了更高的要求。中国药典记载五倍子中鞣质的含量以没食子酸[1]计不低于50%。本文参照中国药典，采用高效液相色谱法测定小儿腹泻散中没食子酸的含量，提高小儿腹泻散的质量标准，为更好地控制该制剂的质量提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪（SPD-M20型检测器、 CTO-20ASVP型柱温箱、SIL-20A自动进样器，日本岛津）；电子天平（BS210S，北京赛多利斯天平有限公司，d=0.1mg）；恒温水浴锅（DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司）；高速中药粉碎机（HX-200型，浙江省永康市溪岸五金药具厂）；超声波清洗器（KQ500DE型，昆山市超声仪器有限公司）；智能恒温电热套（DRT-SX型，郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 材料 没食子酸对照品（批号：110831-201204，中国食品药品检定研究院）；小儿腹泻散（批号：20141224、20141226、20141228，新疆医科大学第二附属医院）；甲醇（sigma，色谱纯）；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Inert Sustain C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）；流速：1.0 ml·min-1；进样量：10μl；柱温：40℃，由对照品色谱（液相检测器为二极管阵列）确定检测波长为271nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品6.2mg，置100ml棕色量瓶中，采用50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得62μg·ml-1没食子酸对照品储备液。

2.3 供试品溶液制备[1] 精密称取小儿腹泻散0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25ml，称定重量，超声处理5min，冷却，再次称量重量，采用50%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 精密量取没食子酸对照品溶液（没食子酸浓度为62μg·ml-1）0.2、0.5、1、3、5、10ml分别置10ml棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。没食子酸的线性回归方程为y=29474x+4186.7，相关系数r=0.9999，表明没食子酸在1.24～62μg·ml-1范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 分别精密吸取浓度为12.4μg·ml-1的同一对照品溶液，连续重复进样6次，进样量10μl，结果峰面积平均值为368037.8，RSD为0.49%，试验结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后1、2、3、6、9、12h进样，记录色谱图，结果没食子酸的平均峰面积为367542.8，RSD为0.15%，试验结果表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 分别精密称取同一批样品6份，按“2.3”项制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl进样，供试品中没食子酸平均含量为5.26mg·g-1，RSD为0.98%，结果表明没食子酸含量测定方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量样品9份，分别精密加入高、中、低浓度对照品溶液各3份，按供试品溶液的制备方法制备，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。平均回收率为99.24%，RSD=0.64%。

2.9 样品含量测定 照供试品溶液的制备方法分别制备3个批次的供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μl进样，记录峰面积，计算没食子酸含量，结果3批样品中没食子酸平均含量为5.18mg·g-1，RSD为1.66%。

3 讨论

3.1 供试品处理 [4-6] 供试品溶剂的选择，分别采用无水乙醇、60%乙醇、甲醇、50%甲醇、纯水对样品进行超声提取，结合液相色谱系统适用性的考察，确定采用50%甲醇作为提取溶剂提取效果最佳，色谱峰能够较好的分离，而含乙醇的溶剂提取出的样品色谱峰不能分离，无法计算峰面积。超声提取时间的考察分别考察了5、10、15、30min，没食子酸的含量无显著性差异。因此，供试品的制备选用50%甲醇超声提取5min。

3.2 流动相的选择[7-10] 实验考察了不同比例甲醇-磷酸溶液、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液作为流动相，均能得到较好的色谱峰。其中当甲醇-0.085%磷酸溶液（15∶85）时，出峰时间较快，但色谱峰分离度不够。经预实验筛选，结合节约成本和保护色谱柱的考虑，确定采用甲醇-0.085%磷酸溶液（6∶94）作为流动相。

小儿腹泻散作为我院特色制剂，疗效显著，但处方成分复杂，不仅由中西药组合，还含有毒性药材朱砂，因此在临床使用与制剂质量控制过程中应该严格控制，加强临床监管，提高制剂质量标准，保障患儿的生命健康。本文结合制剂的特点，参照中国药典中五倍子的含量测定方法，建立了小儿腹泻散中没食子酸的HPLC含量测定方法，该方法简单，灵敏度高，稳定性好，可用于小儿腹泻散的质量控制。

参考文献

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（收稿日期：2015.03.23）