张喆 唐明敏 范瑞艳 蔡大任 杨文宁 刘洋

摘要：目的 以序贯代谢思想为指导，研究银杏叶片剂成分体内代谢动态情况。方法 以在体大鼠封闭肠环法为研究手段，结合色谱指纹图谱，对银杏叶片剂经过口服消化系统空间顺序代谢，即肠道菌群、肠壁细胞及肝代谢后的入血成分谱进行考察及对比研究。结果 对可检测到的色谱峰分析显示，银杏叶片剂有12个色谱峰在肠道内被肠道菌群代谢，经肠壁代谢产生7个色谱峰，银杏叶片剂中的成分大部分被肝代谢，3个原药色谱峰以原型入血。结论 本研究对银杏叶片剂在口服途径不同代谢部位的情况进行了定性描述，可为该制剂的质量控制、机制阐述及再次开发提供参考。

关键词：银杏叶提取物片剂；序贯代谢；肝代谢；肠道菌群代谢；肠壁代谢；指纹图谱；封闭肠环法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.022

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0078-05

Sequential Metabolism Study on Ginkgo Folium Tablet in Digestive System ZHANG Zhe， TANG Ming-min， FAN Rui-yan， CAI Da-ren， YANG Wen-ning， LIU Yang （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract：Objective To investigate dynamic metabolism in vivo of Ginkgo Folium Tablet under the guidance of sequential metabolism thoughts. Methods In situ closed-loop in rats was carried out to study sequential metabolism of Ginkgo Folium Tablet through oral digestive system， namely to investigate and compare the intestinal flora metabolism， the gut wall metabolism and hepatic metabolism， combined with chromatographic fingerprint of blood samples. Results The analysis showed that 12 peaks in Ginkgo Folium Tablet were metabolized by intestinal flora， and 7 peaks generated through the gut wall. Most components of Ginkgo Folium Tablet were metabolized in liver， and 3 original medicine components were directly into the blood. Conclusion This study conducts a qualitative description of metabolism of Ginkgo Folium Tablet in different parts of the oral route， and provides references for the quality control， mechanism explanation and secondary development for Ginkgo Folium Tablet.

Key words：Ginkgo Folium Tablet；sequential metabolism；hepatic metabolism；intestinal flora metabolism；gut wall metabolism；fingerprint；in situ closed-loop

序貫代谢，是指以口服药物在体内的空间顺序为依托，分别对药物在肠道内的肠道菌群代谢、肠壁酶代谢、肝代谢进行系统研究，考察药物成分的体内代谢历程，为药物药效物质基础的筛选及其作用靶点的研究奠定基础[1]。银杏叶提取物片剂药效药理作用研究较明确[2]，该制剂有良好的治疗心脑血管及中枢疾病

基金项目：北京中医药大学大学生科研课题质量工程项目（201310026071）

通讯作者：刘洋，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn

药效[3]。本试验以银杏叶片剂为研究对象，以序贯代谢为研究思路，结合色谱指纹图谱实现多成分同时检测，对口服银杏叶片剂成分在消化道内的代谢情况进行考察[4]，并对其原药成分与代谢产物进行分析与推测，为该制剂的二次开发提供参考。

1 仪器、试药与动物

Waters液相色谱系统（600 四元泵，美国Waters公司），2487双波长紫外检测器，Empower 2工作站；离心机（1-15PK，德国西格玛公司），漩涡混合仪（VX-200，深圳市赛泰克生物科技有限公司），恒温水浴锅（HH-2，江苏省金坛市晨阳电子仪器厂），制氧机（氧立得，北京市皓月楼工贸有限责任公司），超声波清洗器（KQ5200E，北京中晟铭科技有限公司），蠕动泵（BT100-1F，保定兰格恒流泵有限公司）。

银杏叶片剂（银杏叶提取物片），德国威玛舒培博士药厂，批号4330213；酶抑制剂（1-氨基苯并三唑），北京百灵威化学技术有限公司。Krebs-Henseleit液（自制）；乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；纯净水；其余试剂均为分析纯。

SPF级健康雄性SD大鼠，9周龄，体质量（300±20）g，北京斯贝福实验动物科技有限公司，合格证号SCXK（京）2011-0004。饲养于符合国家标准的屏障环境中，室温22～24 ℃，相对湿度60%。适应性喂养1周以上，自由饮水和进食。

2 方法

2.1 药物制备

取银杏叶片剂10片，去除包衣后，研成粉末，精密称取200 mg，加水30 mL，超声（功率200 W，频率40 kHz） 20 min，过滤，滤液浓缩为1 mL，得银杏叶提取物，放置，待用。

2.2 人工血液灌流液制备

抗凝后的牛血3000 r/min离心10 min，弃上清液，加生理盐水洗涤3次以上至上清液不红即可，得洗涤牛红细胞。人工血液灌流液为含有20%牛红细胞、2.2%右旋糖酐、1%氨基酸、6%葡萄糖的Krebs- Henseleit缓冲液，并在输血前供氧[5]。

2.3 在体封闭肠环法研究序贯代谢

2.3.1 肠道菌代谢考察 大鼠禁食24 h，自由饮水，称重，麻醉，剪开腹部，选择为盲肠以下8 cm长肠段，将银杏叶提取物注入肠腔，当药液到达肠段末端，用丝线结扎，取下注射器并结扎进口端肠段。从颈静脉开始输血，同时在肠系膜静脉采血，流速0.5 mL/min，1 h后处死大鼠[6-8]。

2.3.2 肠壁细胞代谢考察 手术方法同“2.3.1”项，肠段用生理盐水冲洗干净肠内容物，注入银杏叶提取物，同法采集血样。另一只大鼠同样按“2.3.1”项下方法手术，肠段冲洗干净后注入含1 mg酶抑制剂的银杏叶提取物。

2.3.3 肝代谢考察 手术方法同“2.3.1”项，将银杏叶提取物注入肠腔后放回腹腔内，1 h后腹主动脉采全血。

2.4 血样处理

血液样品于4 ℃、9000 r/min离心10 min，吸取上清液，加3倍量甲醇涡旋2 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，减压浓缩后过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，供高效液相色谱（HPLC）分析。

2.5 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil C18（ODS-2）柱（5 μm， 4.6 mm×250 mm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0→11 min，13%→20%B；11→17 min， 20%→21%B；17→34 min，21%→25%B；34→44 min， 25%→30%B；44→54 min，30%→75%B）；流速1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm；进样量：20 μL。

3 结果

3.1 银杏叶片肠道菌代谢情况

经肠道菌群代谢后，血样中检测到14个色谱峰，与原药指纹图谱比较，峰2、9、12、14、16、17、29共7个色谱峰可直接进入血液，峰1、6、10、11、21、22、23、24、25、28、30、31共12个原色谱峰可能在肠道内被肠道菌代谢，并且肠道菌群代谢后产生7个新峰，其中峰X5、X7为肠壁代谢产物，色谱图见图1。

3.2 肠壁代谢情况

肠壁细胞内存在的药物代谢酶主要为CYP450酶系，通过加入广谱型酶抑制剂前后血液图谱的对比可推测药物成分在肠壁代谢的情况，色谱图见图2。图中A与B对比可知，经肠壁吸收共有25个色谱峰被检出，其中18个为原药色谱峰，7个新色谱峰（X1～X7）；加入广谱型酶抑制剂后，B、C对比可认为原药峰3、13在吸收过程中被肠壁细胞酶代谢。峰X2、X4加入酶抑制剂后未在血样里检测到，推测该成分为被抑制的肠壁酶代谢产物。峰X1、X3、X5、X6、X7在加入酶抑制剂后仍出现在血样里，推测这几个色谱峰可能为其他肠壁酶的代谢产物，未被该酶抑制剂抑制；此外，加入酶抑制劑后血样中检测出2个色谱峰，推测可能为其他肠壁酶的代谢产物，该酶与被抑制的酶存在竞争作用；色谱峰14、21、22、23、30共5个原药峰在加入酶抑制剂后没有吸收入血，推测其吸收可能与某些被代谢的成分存在相互作用。

3.3 肝代谢结果

经过肝代谢后，在血液中检测到13个色谱峰，肠道吸收后的成分大多数被肝代谢，原药峰2、17被肝代谢，峰12、16、29未被肝代谢；峰X7可推测为肠道代谢与肝代谢的共同产物；明确检出7个肝代谢产物，其中峰8、10、20、28可能在肠道菌代谢后又经过肝转化为原型，其他3个成分为肝代谢产物。色谱图见图3。

注：A.原药；B.无肠道菌吸收代谢血样；C.肠道菌吸收代谢血样；D.空白血样

图1 肠道菌群代谢分析血样指纹图谱

注：A.原药；B.无肠道菌肠吸收代谢血样；C.加酶抑制剂肠吸收血样；D.空白血样

图2 肠壁代谢分析血样指纹图谱

A.原药；B.肠道菌肠吸收代谢血样；C.肝代谢血样；D.空白血样

图3 肝代谢分析血样指纹图谱

4 讨论

本研究对银杏叶片剂在口服途径吸收代谢过程中不同代谢部位的情况进行了定性描述，可为该制剂的质量控制、机制阐述及再次开发提供参考。如经过肝代谢后仍以原形存在的色谱峰8、10、16、20、28、29可被遴选作为其质量控制成分；被肠壁酶细胞代谢及被肠道菌代谢的原成分及代谢产物可进一步明确该药药效机制是否与肠壁酶或肠道菌有关联；此外，入血的代谢产物可作为新的先导化合物的候选成分。

序贯代谢思想实现了对口服药物体内吸收代谢的空间顺序的逐一研究，重点比较了不同代谢部位对药物化学成分的处置，体现了口服药物体内过程的现实情况，为药物体内代谢研究提出了新思路。但是，药物体内代谢并非单纯不同组织器官有序的处理，其分子机制的复杂性、空间上的连续性，以及时间上的并行性还有待于进一步研究，笔者研究团队将在后续研究中体现。

此外，本试验将中药传统的体外筛选转变为体内研究，只是对药物化合物体内的转化结果进行了定性表述，其机制仍需进一步探究。中药的多成分是其体内代谢研究重点和难点，指纹图谱的建立虽然实现了多成分同时检测，但只是其庞大成分群中的一部分内容。同时，多成分体内吸收代谢的相互作用等也需要考虑。目前的研究虽不能完全阐明中药多成分在体内的处置过程，但为其后续递进式研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 刘洋，潘艳丽，王晶娟，等.多成分药物代谢理论及技术方法分析[J].中草药，2014，45（12）：1663-1667.