罗德梅 单志桂 葛金莲 刘青 罗莉

摘要：目的 探讨苦杏仁苷对Ⅱ型胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠的抗炎作用机制。方法 Wistar大鼠隨机分为正常组、模型组、苦杏仁苷组、雷公藤多苷组。采用Ⅱ型胶原诱导建立CIA大鼠模型，造模后第15日，各给药组予相应药物灌胃，连续28 d。ELISA检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子-1（sICAM-1）水平，免疫组化法检测大鼠关节滑膜TNF-α表达。结果 苦杏仁苷组和雷公藤多苷组关节滑膜TNF-α阳性表达相似，较模型组明显减少，且苦杏仁苷组和雷公藤多苷组大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平与模型组比较均明显下降（P<0.05），与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 苦杏仁苷通过有效抑制TNF-α、sICAM-1水平及TNF-α表达，达到治疗类风湿关节炎的作用。

关键词：苦杏仁苷；Ⅱ型胶原诱导性关节炎；肿瘤坏死因子-α；细胞间黏附分子-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.021

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0075-03

Effects of Amygdalin on TNF-α and sICAM-1 of Rats with Type II Collagen-induced Arthritis LUO De-mei， SHAN Zhi-gui， GE Jin-lian， LIU Qing， LUO Li （The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Abstract：Objective To discuss effects of anti-inflammatory mechanism of amygdalin on rats with type II collagen-induced arthritis （CIA）. Methods Wistar rats were randomized into normal group， model group， amygdalin group， and tripterygium group. Type II CIA rat models were established. From the 15th day after the modeling establishment， each administration group was given corresponding dose of medicine for continuous 28 days. Levels of TNF-α and sICAM-1 were detected by ELISA in serum of rats， and expression of TNF-α was detected by immuno- histochemical method. Results TNF-α positive expression in amygdalin group and tripterygium group was similar and significantly reduced compared with model group. Levels TNF-α and sICAM-1 in amygdalin group and tripterygium group significantly decreased compared with those in model group （P<0.05）， without significant difference compared with normal group （P>0.05）. Conclusion Amygdalin can inhibit the expression of TNF-α and levels of TNF-α and sICAM-1， in order to treat rheumatoid arthritis.

Key words：amygdalin；type II collagen-induced arthritis；TNF-α；sICAM-1；rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病，其确切的病因和发病机理目前尚不明确。苦杏仁苷是苦杏仁中的有效成分，广泛存在于蔷薇科植物的种子中，现代药理研究表明，其具有抗动脉粥样硬化、

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（2014211C047）；新疆医科大学第一附属医院药学专项基金（2012YX06）

通讯作者：罗莉，E-mail：luoli.6@163.com

抗纤维化、免疫调节、抗肿瘤、抗炎等作用[1]。Hwang等[2]采用体外脂多糖（LPS）诱导的细胞系和角叉菜胶诱导的踝关节炎大鼠模型研究显示，苦杏仁苷对关节炎具有较好的消炎和镇痛作用。本研究观察苦杏仁苷对Ⅱ型胶原诱导性关节炎（type Ⅱ collagen induced arthritis，CIA）大鼠干预后大鼠关节滑膜组织病理、滑膜和血清中细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达及血清中细胞间黏附分子（sICAM-1）的变化，为临床防治RA提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性Wistar大鼠45只，7～8周龄，体质量（180±20）g，新疆医科大学动物实验中心提供，合格证号IACUC-20130319012。实验期间饲养于新疆医科大学第一附属医院实验动物科学研究部，SPF级常规饲养。

1.2 药物

苦杏仁苷购于成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-13011801；雷公藤多苷片购自于新疆医科大学第一附属医院，远大医药黄石飞云制药有限公司，批号20130105。

1.3 主要试剂与仪器

牛Ⅱ型胶原（CⅡ），Sigma公司；弗氏完全佐剂，Sigma公司；大鼠TNF-α、sICAM-1定量试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；脱钙液，北京中杉金桥生物技术有限公司；TNF-α一抗体，武汉博士德生物工程有限公司；pV二步法免疫组化检测试剂、PBS缓冲液、抗体稀释液，北京中杉金桥生物技术有限公司。切片机，德国LEICA RM2135；光学显微镜，中国NIKON YS100；显微照相机，德国LEICA DM3000；孵育温箱，日本EYELA SLI-700；数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

2 实验方法

2.1 造模与分组

实验大鼠适应性喂养1周，随机选取8只为正常组，其余大鼠参照文献[3]方法建立胶原诱导的关节炎模型（CIA）。将CⅡ溶于预冷的0.1 mol/L冰醋酸中，终浓度为4 mg/mL，4 ℃过夜。将溶解于冰醋酸CⅡ加入等體积的弗氏完全佐剂在冰浴条件下使二者充分乳化。于大鼠左足跖肉垫及尾根部多点皮内注射CⅡ乳剂0.2 mL/只进行初次免疫，7 d后，使用上述乳剂于足跖及尾根部再次加强免疫。造模14 d后参照文献[4]进行评估，于致炎第21日剔除未发病大鼠，将造模成功的35只大鼠随机分为模型组5只、雷公藤多苷组10只及苦杏仁苷高、低剂量组各10只。

2.2 大鼠关节炎症指数评定

初次免疫后每周对实验大鼠进行关节炎症评分（arthritis index，AI），大鼠关节炎表现以0～4分计算，分为5级。0分：无关节炎症状；1分：单个爪或趾（指）的红肿；2分：2个关节受累；3分：2个以上关节受累；4分：全部爪及趾均发生严重关节炎。每只大鼠AI为4只包括趾（指）在内的整个爪评分之和。初次免疫第14日后AI≥6分及以上的大鼠提示造模成功，用于实验。

2.3 给药及取材

雷公藤多苷组给药剂量为1 mg/kg，苦杏仁苷组给药剂量为120 mg/kg，临用前分别用灭菌蒸馏水配制，给药体积1 mL/100 g灌胃，正常组、模型组予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续4周。游标卡尺记录后足踝关节肿胀情况。给药4周后大鼠称重，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，参照文献[4]方法，股动脉采血，分离血清，4%多聚甲醛固定分离膝关节滑膜作为病理及免疫组织化染色标本。

2.4 组织病理学观察

常规乙醇梯度脱水，进行石蜡包埋?切片?HE染色，光学显微镜下进行观察?

2.5 血清肿瘤坏死因子-α和细胞间黏附分子-1测定

ELISA检测血清TNF-α、sICAM-1，按照试剂盒说明书进行操作。

2.6 免疫组化染色检测大鼠关节滑膜中肿瘤坏死因子-α表达

切片脱水脱蜡、水化，PBS洗3次×5 min，滴加3%H2O2室温10 min阻断内源酶，PBS洗3次×5 min， 0.01 mol/L柠檬酸盐抗原修复液，微波修复10 min，室温冷却，蒸馏水、PBS依次洗1次，各 5 min，加一抗，4 ℃冰箱过夜。将湿盒置于室温1 h，加二抗，37 ℃温箱孵育25 min，PBS洗3次，每次5 min。新鲜配置的DAB显色液进行显色，检测滑膜中TNF-α表达?苏木素复染、盐酸乙醇分化、返蓝、脱水、透明、中性树胶封片。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据用 —x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 膝关节滑膜病理观察结果

给药28 d后，镜下观察可见正常组大鼠滑膜组织学结构正常，细胞排列清晰，未见增生，无明显炎性细胞聚集浸润；模型组大鼠滑膜增厚明显，排列紊乱，有新生血管生成，大量炎性细胞浸润；苦杏仁苷组和雷公藤多苷组大鼠滑膜增生，炎性细胞浸润及血管生成较模型组明显减轻。

4.2 苦杏仁苷对大鼠关节肿胀程度的影响

与正常组比较，模型组大鼠关节明显肿胀（P<0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠第7、14、21、28日关节肿胀均减轻（P<0.05），组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

4.3 苦杏仁苷对大鼠外周血中肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子-1的影响

给药28 d后，与模型组比较，苦杏仁苷组、雷公藤多苷组大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平均明显下降（P<0.05），与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平比较（—x±s，μg/L）

组别 只数 sICAM-1 TNF-α

正常组 8 20.1±0.4 59.2±7.1

模型组 5 22.0±1.5 74.2±8.7

苦杏仁苷组 10 19.6±0.9# 59.3±7.7#

雷公藤多苷组 10 20.4±0.3# 60.2±8.6#

4.4 关节滑膜免疫组化染色观察结果

给药28 d后，免疫组化染色显示，炎性细胞因子TNF-α阳性表达区域呈棕黄色。正常组大鼠关节滑膜中仅见极少量的TNF-α阳性表达；模型组大鼠关节滑膜可见TNF-α阳性表达明显增多，各给药组TNF-α阳性表达较模型组明显减少。结果见图1。

正常组 模型组 苦杏仁苷组 雷公藤多苷组

图1 各组大鼠滑膜中TNF-α表达（免疫组化染色，×400）

5 讨论

RA属中医学“痹证”范畴，目前，研究RA模型包括佐剂性关节炎模型（ajudvant arthritis，AA）和CIA。AA制作方便简单，可广泛应用于多种动物，但它与RA差异较大，病变具有自限性。CIA大鼠模型是Trentham等[5]于1977年首次建立，现已公认为是研究RA的经典模型。

TNF-α是RA中重要炎性细胞因子，TNF-α可诱导滑膜细胞产生多种细胞因子，促进滑膜细胞增殖，促进RA滑膜细胞凋亡，引起炎症反应持续发生并逐渐出现骨侵蚀；ICAM-1是一类黏附分子，为淋巴细胞相关抗原-1的配体，通过介导细胞间、细胞与细胞外基质

间的黏附作用，促进炎症的发生和发展。雷公藤因具有抗炎、免疫抑制等作用，目前已被用于治疗RA等多种自身免疫性疾病，并取得肯定疗效，但有一定的不良反应。有文献报道，苦杏仁苷对AA能够抑制炎症，增强巨噬细胞的吞噬功能，具有调节免疫功能的作用，苦杏仁水煎剂对AA大鼠具有软骨组织破坏减轻，组织学上有明显改善炎症程度作用[6]。本实验结果显示，大鼠滑膜组织病理切片在模型组显示滑膜增厚明显，排列紊乱，有新生血管生成，大量炎性细胞浸润；给药组大鼠滑膜增生、炎性细胞浸润及血管生成较模型组明显减轻。另外，给药组大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平与模型组比较均明显下降，且给药组TNF-α阳性表达相似，较模型组明显减少，提示苦杏仁苷通过抑制TNF-α及sICAM-1的表达，有效抑制CIA大鼠关节肿胀，减轻病理损伤，进而达到抗RA的作用，且疗效与雷公藤多苷相似，可为RA的中医治疗用药及中医免疫学研究提供一定的启示。

参考文献：

[1] Deng JG， Wang HL， Liu YD， et a1. Anti-atherosclerotic effects mediated by the combination of probucol and amygdalin in apolipoprotein e-knockout mice fed with a high fat diet[J]. J An Vet Adv，2012，11（1）：20-25.

[2] Hwang H， Lee H， Kim C， et al. Inhibitory effect of amygdalin on lipopolysaccharide-inducible TNF-α and IL-1β mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis[J]. Journal of Micro-biology and Biotechnology，2008，18（10）：1641-1647.

[3] 李寶丽，唐方，庞晓东.Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠模型制备[J].中国免疫学杂志，2006，22（5）：350-352.

[4] 石磊，李小峰，王彩虹，等.大鼠胶原诱导性关节炎模型的制备及评价[J].临床医药实践，2011，20（4）：245-247.

[5] Trentham DE， Townes AS， Kang AH. Autoimmunity to type Ⅱ collagen：an experimental model of arthritis[J]. J Exp Med， 1977，146：857-868.

[6] 方伟蓉，李运曼，钟林霖.苦杏仁苷对佐剂性炎症影响的实验研究[J].中国临床药理学与治疗学杂志，2004，9（30）：289-293.

（收稿日期：2014-12-17；编辑：华强）