卞华 徐艳琴 韩立 叶松山 陈丽平 张培华

【摘 要】目的：探讨温阳化浊通络方含药血清对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移的影响。方法：通过对Wistar大鼠灌胃制备温阳化浊通络方含药血清，体外培养正常人皮肤成纤维细胞，分为空白对照组、Wnt组和温阳化浊通络方组，作用24，48，72 h后，分别用RT-PCR和Western blot法检测α-SMA mRNA及蛋白的表达，Transwell试验检测成纤维细胞迁移情况。结果：与空白对照组比较，Wnt组在不同作用时间下能诱导人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达（P < 0.01），增加其迁移数量（P < 0.01）；与Wnt组比较，温阳化浊通络方组在不同作用时间下能够显著抑制Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达（P < 0.05，P < 0.01），同时阻止其迁移（P < 0.01）。结论：温阳化浊通络方含药血清能抑制Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移，具有阻止或延缓系统性硬化病纤维化的潜能。

【关键词】 系统性硬化病；温阳化浊通络方；皮肤成纤维细胞；表型转化；迁移；Wnt-1

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.08.001

【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effects of Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription（温阳化浊通络方）on the phenotype transformation and migration of human skin fibroblast induced by Wnt-1.Methods：Medicated serum of Wistar rats was got by intragastric administration of Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription and normal human skin fibroblasts were cultured in vitro.The rats were divided into a blank control group，a Wnt group and a Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription group.Respectively after 24，48，72 hours，RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of α-SMA mRNA and protein，and Transwell was used to detect the migration of fibroblasts.Results：Compared with the blank control group，human skin fibroblasts a-SMA mRNA and protein expression in the Wnt group could be induced in different time（P < 0.01），and the number of migration increased（P < 0.01）.Compared with the Wnt group，human skin fibroblasts a-SMA mRNA and protein expression in the Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription group were obviously inhibited（P < 0.05，P < 0.01） and their migration were prevented（P < 0.01）.Conclusion：Medicated serum of Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription can inhibit the phenotype transformation and migration of human skin fibroblast induced by Wnt-1，having the potential to prevent or delay systemic sclerosis fibrosis.

【Keywords】systemic sclerosis；Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription（温阳化浊通络方）；skin fibroblasts；phenotype transformation；migration；Wnt-1

系统性硬化病（systemic sclerosis，SSc）是以胶原等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积为特征的自身免疫性疾病，纤维化是SSc发病过程中最突出的特点，与其预后和死亡率密切相关[1]。前期研究表明，温阳化浊通络方治疗SSc具有较好疗效[2]，同时温阳化浊通络方对博莱霉素诱导的SSc模型小鼠的皮肤硬化具有一定的抑制作用[3]。本研究运用血清药理学方法，以人皮肤成纤维细胞为研究对象，观察温阳化浊通络方含药血清对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移的影响，进一步探讨其拮抗SSc纤维化的可能作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠30只，SPF级，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXL（京）2012-0001。

1.2 药物与试剂 温阳化浊通络方煎剂由黄芪

30 g、党参15 g，桂枝9 g、淫羊藿12 g、积雪草15 g、白芥子9 g等10味药物组成，购于南阳理工学院附属第一医院，该方一剂共含生药141 g，水煎，取滤液浓缩成含生药2.5 g·mL-1。Wnt-1（美国Peprotech公司）；DMEM培养基、胰酶（美国Sigma公司）；胎牛血清、Trizol（美国Gibco公司）；α-平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗体、辣根过氧化物酶标记IgG二抗（美国Santa Curz公司）；化学发光试剂盒（美国Pierce公司）；逆转录试剂盒、PCR试剂（美国Promega公司）。

1.3 实验仪器 Ti-S型研究级倒置显微镜（日本Nikon公司）；Thermo 8000型CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；ABI ViiA7型PCR仪（美国ABI公司）；Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio Rad公司）；电泳仪、转膜仪（美国Bio Rad公司）；MR4100型酶联免疫分析仪（美国Dynatech公司）等。

2 方 法

2.1 含药血清的制备 选用30只雌性Wistar大鼠，适应性喂养1周后，按体质量递增顺序编号，参照随机数字表将其分为空白组、温阳化浊通络方组，每组15只。温阳化浊通络方组以预试验确定的10倍成人剂量温阳化浊通络方煎剂灌胃，空白组以等量生理盐水灌胃。10 d后，分别于末次灌药后30 min，运用心脏穿刺法采血，分离血清，然后采用断头法处死大鼠。采用HPLC-MS法测定药物主要成分含量，制备含药血清和空白血清。无菌分离血清，56 ℃灭活30 min后，-80 ℃冰箱保存，备用。

2.2 皮肤成纤维细胞培养及鉴定 在局麻及无菌条件下，切取2例女性整形外科患者上臂外侧正常皮肤组织，入选者均知情同意。采用组织块培养法原代培养成纤维细胞[4]，倒置相差显微镜下进行细胞形态学鉴定，并对第2代细胞分别以角蛋白和波形蛋白单克隆抗体进行免疫组化鉴定。3～6代细胞用于实验，多余细胞放液氮中冻存，备用。

2.3 RT-PCR法检测α-SMA mRNA表达 将处于对数生长期的正常人皮肤成纤维细胞分别接种于

24孔培养板，每孔含5×105个细胞。待细胞贴壁后，换入无血清DMEM培养基，继续培养24 h。实验分3组：空白对照组（加终质量分数为15%空白血清）、Wnt组（加2 ng·mL-1 Wnt-1 100 μL和终质量分数为15%空白血清）、温阳化浊通络方组（加2 ng·mL-1 Wnt-1 100 μL和终质量分数为15%的温阳化浊通络方含药血清），每组设3个复孔。37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱，培养至24，48，72 h后，分别收集各组细胞，运用TrizoI试剂一步法提取人皮肤成纤维细胞总RNA。逆转合成cDNA后，取模板cDNA进行PCR扩增。引物由北京赛百盛生物工程公司设计合成，序列分别为：α-SMA，上游5'-CGATAGAACACGGCATCATC-3'，下游5'-CATCAGGCAGTTCGTAGCTC-3'，扩增长度316 bp；GAPDH，上游5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3，扩增长度258 bp。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，退火40 s （温度分别为54 ℃、62 ℃），72 ℃延伸40 s，72 ℃最后延伸10 min，30个循环。上述PCR产物经质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳约30 min，然后以凝胶成像仪紫外光下拍照，Quantity One图像分析软件进行光密度分析，分别计算α-SMA mRNA与内参GAPDH的灰度比值，得出相对表达量。

2.4 Western blot法检测α-SMA蛋白 分别收集各组细胞，加入蛋白裂解液裂解，冰浴30 min。4 ℃ 10 000 r·min-1的离心速度离心10 min，收集上清，用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白定量，-70 ℃保存。常规方法进行质量分数为20%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜。按0.1 mL·cm-2加入封闭液，室温封闭2 h后，依次加入一抗（1∶1000稀释），室温下轻摇2 h，4 ℃孵育过夜。弃去反应液，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min；加入二抗（1∶2000稀释），37 ℃孵育1 h，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min。ECL发光试剂对硝酸纤维素膜进行显色反应，用电泳凝胶成像系统成像并对免疫印迹条带进行半定量分析，用β-肌动蛋白（β-actin）作内参照，以与β-actin的比值表示各组蛋白表达水平。

2.5 Transwell试验检测成纤维细胞迁移情况

首先分别在细胞小室的上室和下室加入FN（50 g·mL-1）溶液进行包被，将上室接种成纤维细胞每孔2×104个，在下室培养液中分别加入Wnt-1或Wnt-1加温阳化浊通络方含药血清。实验分3组（同2.3），每组设3个复孔。常规培养24 h后，将上室取出，用棉签去上室滤膜内面细胞，对迁移至滤膜外的细胞，用质量分数为2%的多聚甲醛固定，Giemsa染色，最后随机选取4个视野（400×），在倒置显微镜下计数迁移过膜的细胞，取其均值。

2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 温阳化浊通络方对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA表达的影响 与空白对照组比较，Wnt-1能诱导正常人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA的表达（P < 0.01）；与Wnt组比较，温阳化浊通络方含药血清在不同作用时间下能够显著抑制Wnt-1诱导的正常人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA的表达（P < 0.05，P < 0.01）。见图1、图2。

3.2 温阳化浊通络方对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞α-SMA蛋白表达的影响 Western blot法检测显示，与空白对照组比较，Wnt-1能诱导人皮肤成纤维细胞α-SMA蛋白的表达（P < 0.01）；与Wnt组比较，温阳化浊通络方含药血清在不同作用时间下能够显著抑制Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞α-SMA蛋白的表达（P < 0.05，P < 0.01）。见图3、图4。

3.3 温阳化浊通络方对Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞迁移的影响 人成纤维细胞迁移数量Wnt组（87.67±13.01）个与空白对照组（31.33±8.50）个比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；与Wnt组比较，温阳化浊通络方组成纤维细胞数量（57.33±12.01）个明显减少（P < 0.01）。

4 讨 论

成纤维细胞目前被公认为是ECM的主要来源细胞，正常情况下处于静息状态，所以成纤维细胞的异常激活并转化为肌成纤维细胞是纤维化形成和发展的中心环节[5-6]，而α-SMA是肌成纤维细胞的标记性蛋白，可反映成纤维细胞表型改变。

Wnt/β-catenin信号通路与SSc纤维化密切相关，在成纤维细胞向肌成纤维细胞发生表型转化中起着重要作用。研究发现，与正常人比较，SSc患者皮损成纤维细胞中β-catenin堆积，靶基因axin-2转录增加。在纤维化皮肤和肺组织中，Wnt-1和Wnt-10b表达增高[7]。动物实验研究表明，Wnt-10b转基因鼠表现皮肤增厚、皮肤纤维化、进行性的皮下脂肪丢失、胶原蛋白堆积、成纤维细胞活化、肌成纤维细胞聚集等，同时皮肤成纤维细胞中有持续存在的Wnt/β-catenin信号，且高表达α-SMA，证实了Wnt/β-catenin信号诱导纤维化的能力[8]。本研究发现，Wnt-1和人皮肤成纤维细胞共同孵育，能明显增加成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达，进一步证实了Wnt-1能诱导静止成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，这与相关文献报道一致[9]。同时本研究还观察到，Wnt-1能够增加成纤维细胞的迁移，因此，抑制Wnt的产生和/或活性，拮抗或阻断Wnt/β-catenin信号通路传导，可以在SSc纤维化治疗中发挥重要作用[10]。

中医学无SSc病名，就其发病和临床表现而言，应属“皮痹”或“皮痹疽”等范畴。笔者突破SSc发病多是“风寒痹阻，寒凝血瘀”的传统认识[11]，基于肺脾肾-皮毛相关理论，以黄芪桂枝五物汤、补肺汤等为基础方创制温阳化浊通络方。该方中黄芪补气益卫固表；党参补益脾肺之气；淫羊藿补肾壮阳，祛风除湿，故重用为君药。积雪草活血化瘀；白芥子温通经络，善散“皮里膜外”之痰，祛除浊邪，俱为臣药。桂枝等辛温通络属佐使之用。诸药相伍，通补并用、标本兼顾，具有补肺健脾益肾、化浊通络之效，共奏扶正祛邪之功。温阳化浊通络方能有效改善SSc患者皮肤积分、雷诺现象及甲襞微循环，降低血浆内皮素、FVC、DLco等水平，治疗SSc效果显著。体外实验表明，温阳化浊通络方能阻止SSc皮肤成纤维细胞周期由G1期进入S期，进而控制细胞分裂，抑制其增殖[12]。动物实验表明，温阳化浊通络方能够干预硬皮病模型小鼠TGF-β1/Smad信号通路中TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的表达，降低皮肤COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量，拮抗SSc纤维化[3]。

本研究从Wnt/β-catenin信号通路角度观察温阳化浊通络方含药血清对人皮肤成纤维细胞表型转化及迁移的影响，结果表明，温阳化浊通络方含药血清能够减少Wnt-1诱导的人皮肤成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达，抑制其迁移，提示温阳化浊通络方可阻止静止成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化，减少其聚集，具有阻止或延缓SSc纤维化进行性发展的潜能。然而，由于Wnt/β-catenin信号通路与其他信号通路存在交叉对话，温阳化浊通络方如何调控Wnt/β-catenin信号通路需进一步深入研究。

5 参考文献

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收稿日期：2015-06-10；修回日期：2015-07-27